琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
发布时间:2019-05-21浏览次数:2380返回列表
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
问题 |
可能原因 |
解决方法 |
DNA Marker降解 |
核酸酶污染 |
每次吸取时更换灭菌枪头,勿将电泳缓冲液带入管中;用后密闭4°C保存 |
保存不当 |
4°C 或-20°C保存,避免多次反复冻融;不可加热 |
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DNA Marker无法正确分离 |
琼脂糖质量差 |
使用质量可靠的琼脂糖制胶 |
电泳缓冲液多次使用后失效 |
更换缓冲液 |
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条带黯淡 |
核酸浓度过低 |
增加上样量 |
核酸降解 |
使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品 |
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DNA条带被示踪染料掩盖 |
提高上样量;避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料 |
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条带模糊或弥散 |
电泳缓冲液多次使用后失效 |
更换缓冲液 |
核酸部分降解 |
使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品 |
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核酸样品纯度差,含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份 |
酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质 |
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电压过低,电泳时间过长 |
根据凝胶大小和电泳缓冲液类型,使用适当的电压进行电泳 |
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染色时间过长或拍照前放置过久,DNA条带弥散 |
电泳结束后及时观察、拍照 |
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条带缺失 |
DNA条带分子量过大 |
使用脉冲凝胶电泳 |
分子量接近的DNA条带没有分开 |
选择适当的凝胶浓度进行电泳 |
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电泳缓冲液使用不当 |
SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段,大片段分子不能完全分离;TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段 |
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电泳时间过长或电压过高,DNA走出凝胶 |
缩短电泳时间,调整电压 |
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电插反,DNA走出凝胶 |
正确连接电方向 |
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条带大小不正确 |
核酸降解或形成聚合物 |
加热处理或重新制备样品 |
λ DNA酶切Marker的cos位点复性 |
电泳前65°C加热5分钟,冰上冷却5分钟以后再上样 |
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相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率 |
判断DNA分子是否有特殊结构,如缺口、超螺旋、二聚体等;富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢 |
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梳子变形,点样孔不在同一水平线上 |
使用完好的梳子制胶 |
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带型异常 |
不同样本的上样条件不同 |
选用相同的上样缓冲液,上样量尽可能接近 |
上样量过大或过小 |
选择合适大小的上样孔,样品应完全覆盖点样孔底部 |
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核酸样品纯度差,含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份 |
酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质 |
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电泳缓冲液未完全浸没凝胶 |
上样和电泳时,确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶 |
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电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性 |
根据凝胶大小和电泳缓冲液类型,使用适当的电压进行电泳 |
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凝胶中加入EB造成染色不均 |
加入EB时充分混匀或电泳结束后再染色 |
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凝胶中有气泡或污染物 |
使用纯水和洁净容器制胶;缓慢灌胶,并赶除气泡 |
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点样孔质量差 |
待凝胶完全凝聚后再取出梳子 |
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小片段扩散,条带模糊,粗 |
错误选择了低浓度凝胶,观察大片段用低浓度凝胶,观察小片段要用高浓度 |
比如观察100bp的小片段用2%凝胶跑电泳 |
琼脂糖质量不好,质量不好的琼脂糖分离小片段容易扩散,即使是使用高浓度凝胶 |
换用质量好的琼脂糖 |
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选择了不合适的电泳缓冲液 |
SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段,大片段分子不能完全分离;TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段 |
DNA凝胶电泳简介
一、实验原理
DNA电泳是基因工程中zui基本的技术,DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离,重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同,DNA电泳主要分两类:
1、聚丙烯酰胺凝胶电泳 适合分离1kb以下的片段,zui高分辨率可达1bp,也用于分离寡核苷酸,在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化,也称PAGE纯化。
2、琼脂糖凝胶电泳 可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异,胶浓度为0.5~0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp~50kb。电泳结果用溴化乙锭(EB)染色后可直接在紫外下观察,并且可观察的DNA条带浓度为纳克级,而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速,在基因工程中较常用。
二、琼脂糖凝胶
琼脂糖是从琼脂中分离得到,由1,3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1,4连接的3,6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成,形成相对分子量为104~105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布,当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接,形成孔径结构,而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。
表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围
琼脂糖/% |
标准 |
高强度 |
低熔点 |
低粘度低熔点 |
0.3 |
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0.5 |
700bp~25kb |
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0.8 |
500bp~15kb |
800bp~10kb |
800bp~10kb |
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1.0 |
250bp~12kb |
400bp~8kb |
400bp~8kb |
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1.2 |
150bp~6kb |
300bp~7kb |
300bp~7kb |
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1.5 |
80bp~4kb |
200bp~4kb |
200bp~4kb |
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2.0 |
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100bp~3kb |
100bp~3kb |
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3.0 |
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500bp~1kb |
500bp~1kb |
4.0 |
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100bp~500bp |
6.0 |
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10bp~100bp |
由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用,因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化,象NaClO4能用于凝胶的裂解,一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。
随着实验技术的发展,也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶:(1)低熔点琼脂糖凝胶,用于DNA片段的回收,且由于该种凝胶中无抑制酶,可在胶中进行酶切、连接等;(2)高熔点凝胶,可分离小于1kb的DNA片段,专用于PCR产物的分析;(3)快速凝胶,电泳速度比普通凝胶中快一倍,可节省实验时间;(4)适用于DNA大片段的分离。(5)其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶,可根据实验要求选择不同类型的,选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。
三、DNA电泳影响因素
DNA为碱性物质,在电泳(缓冲液pH=8)时带负电荷,在一定的电场力作用下向正泳动。而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加,荷质比是一常数,故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。电泳中影响DNA分子泳动的因素很多,主要分两方面:DNA分子特性和电泳条件。
1、DNA分子大小:DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大,泳动也越慢,迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。
2、DNA分子构型:对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量,因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同,zui终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率:超螺旋zui快、线状分子次之,开环分子zui慢。
3、不同的胶浓度:对于同种DNA分子胶浓度越高,电泳速率越慢。不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别,浓度较稀的胶线性范围较宽,而浓的胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离(有时甚至用2%的凝胶),而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。
4、电场强度:电泳时为了尽快得到实验结果,所用的电场强度约为5V/cm,这样的场强下虽能得到结果,但分辨率不高。在精que测定DNA分子大小时,应降低电压至1V/cm。电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄,电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。实验中要根据需要选择合适电压,如对于DNA大片段的分离可适当选择较低电压进行(在Southern杂交中的DNA电泳),避免托尾现象的产生;而对于小分子DNA,由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊,可选用相对较高的电泳以缩短电泳时间。
5、溴化乙锭:简称EB,电泳中的染色剂,具有扁平结构,能嵌入到DNA碱基对间,对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时,原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变,电泳迁移速度由快变慢;当嵌入的EB分子进一步增加时,DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变,这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离EB质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml,即电泳时所加的浓度。因此一般电泳可以忽略此因素,而对于特殊电泳,消除此因素影响可采用电泳后染色。
6、电泳缓冲液:目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳:TAE、TBE和TPE,其组成及特点见表2。一般常用的DNA电泳选用TAE较多,其电泳时间较快,而且成本比较低,但是其缓冲容量较低,需经常更换电泳液。
表2 常用DNA电泳缓冲液
四、DNA上样缓冲液
电泳中DNA点样前必须加入一定量的上样缓冲液,主要作用如下:
1、螯合Mg2+,防止电泳过程中DNA被降解,一般上样缓冲液中含10mmol/L的EDTA。
2、增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内,一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖,这样可以增加样品的比重。而在大片段电泳中采用Ficoll(聚蔗糖),可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。
3、指示剂监测电泳的行进过程,一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿,它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。
目前厂商提供的限制性内切酶中都有赠送的上样缓冲液,一般为10×上样缓冲液,DNA样品中仅需加入1/10的量即可,加入过多的上样缓冲液会造成电泳轻微的托尾现象。
五、DNA上样量的控制
在分析性电泳中,一般样品投入量达50~100ng/带即可观察到清晰结果,而对于珍贵DNA样品则上样量达电泳的zui低分辨率5~10ng/带也可。而对于一定量的DNA,当电泳时采用较薄的梳子制胶,则电泳时DNA条带相对较窄,观察较清晰;而随着电泳时间的延长,由于DNA分子本身有一定的扩散,电泳条带也会变浅。
对于染色体DNA的酶切片段包含各种大小的条带,上样量即使超过10mg条带也不会托尾,而单一条带(>10 kb)当上样量超过200ng就有可能产生托尾现象。