XH009 动物组织/细胞线粒体提取试剂盒
产品简介
北京百奥莱博供应的动物组织/细胞线粒体提取试剂盒用于科研试验,我公司的动物组织/细胞线粒体提取试剂盒品质上佳,经过多年的开发生产,已然非常成熟,欢迎广大新老客户订购。...
产品详细介绍
特别提示:包括动物组织/细胞线粒体提取试剂盒在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:动物组织/细胞线粒体提取试剂盒
英文名称:Animal tissue/cell Mitocho
产品货号:XH009
产品规格:50T|100T
本试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织(肝或脑组织)和硬组织(肌肉)以及培养细胞的线粒体的制备。其制备物产量高,可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。
试剂盒组成:
组份 | 50T | 100T |
Lysis Buffer | 50mL | 100 mL |
Mito-Wash Buffer | 25 mL | 50mL |
Store Buffer | 5 mL | 10 mL |
保存条件:4℃可保存一个月,长期请置于-20℃保存。
操作步骤:
1.样本处理
a.组织匀浆:称取100~200mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等,PBS或生理盐水冲洗,洗净血水,滤纸吸干,用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer,0℃冰浴上下研磨组织20次;
b.培养细胞匀浆:消化细胞,PBS洗涤,800×g 5~10min离心收集细胞。计数。每次提取需要5×107个细胞,加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer重悬细胞,将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内,0℃冰浴研磨30~40次;
2.将组织或细胞匀浆物转移到离心管,4℃,1000×g离心5min;
3.取上清,加入一新的离心管中,4℃,1000×g再次离心5min。
4.取上清,加入一新的离心管中,4℃,12,000×g离心10min。离心后的上清含胞浆成分,可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管,线粒体沉淀在管底;
5.在线粒体沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重悬线粒体沉淀,4℃,1000×g离心5min;
6.取上清,加入一新的离心管中,4℃,12,000×g离心10min。弃上清,高纯度的线粒体沉淀在管底;
7.用50~100μL Store Buffer或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀,立即使用或-70℃保存。
注意事项:
1.为保证获得完整的线粒体,是全程低温操作。第二是快速。第三,在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的zuì关键环节。与组织块相比,培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁,因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。
2.以离心力g计算正确的离心速度,不同的离心机可据此计算离心速度。
3.进行Western Blot和2D-胶电泳,可直接加入上样缓冲液裂解线粒体。
一般低温度心机都有离心力显示,如果没有,可以用以下公式简单的换算。
G=1.11×(10-5)×R×[rpm]2
G为离心力,一般以g(重力加速度)的倍数来表示;[rpm]2即:转速的平方;R为半径,单位为厘米。
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名称:Percoll
货号:BTN131134
规格:250mL
Percoll是一种常用的低粘度的密度梯度介质,由直径在15-30nm的硅胶颗粒组成,颗粒外包被了聚乙烯吡咯烷酮(PVP),为化学惰性,不会影响细胞的活性。
产品特点:
1.Percoll渗透压很低(<20mosm/kg H2O),粘度也很小,可形成高达1.3g/ml 密度。
2.采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200~1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。
3.离心后能形成1-1.3g/mL的密度梯度,可用于分离各种悬浮的细胞、线粒体、叶绿体和病毒(可小到70S)。
4.由于Percoll扩散常数低,所形成的梯度十分稳定。此外,Percoll不穿透生物膜,对细胞害,因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒,还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
5.Percoll溶液高压灭菌,必须进行不添加盐或蔗糖。盐的存在会引起percoll糊化,蔗糖的存在会引起焦糖化。
储存条件:常温运输和保存,有效期五年(未开封状态)。
使用方法:
1.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备:先用9 份Percoll与1份 8.5% NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压,然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。
Percoll浓度(%) | 70 | 60 | 50 | 40 | 30 | 20 |
比重g/ml | 1.090 | 1.077 | 1.067 | 1.056 | 1.043 | 1.031 |
2.不连续密度梯度Percoll层的制备:先将试管壁用牛血清湿润,除去多余血清,这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下,使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置,有时相邻两层Percoll 比重相差不大时,可将Percoll液放入注射器中,小针头斜面紧贴管壁,任其自然慢慢流下。
3.装样:样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异,一般加样体积不宜过大,细胞浓度也不可过高,否则会影响细胞的分离和回收。
4.离心:一般采用离心力为400g,时间20~25min。由于多层Percoll 之间密度差别不大,因此离心机加速、降速时要慢,要平稳。
5.取样:当所要分离的细胞大部分在两层的界面时,可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll 层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。
分离纯化细胞举例
1.富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化:按顺序由下向上逐层加50%、47.5%、45%、42.5%和40%五种不同密度的Percoll,如用10ml 试管(或塑料管)分离,每层Percoll约1.2~1.5ml,初步从外周血中分离的PBMC细胞1×108悬于1ml培基中,按要求装样、离心和取样。一般富含NK 杀伤活性的LGL细胞位于42.5%与45%Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。
2.纯化淋巴母细胞和除去死细胞:分别叠加50%和30%Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者),按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞;两层Percoll之间为淋巴母细胞,纯度和回收率在80%以上,位于30%Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。
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