BTN11-710 大肠埃希氏菌

大肠埃希氏菌是高品质的细菌PCR检测试剂盒产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于生化实验研究等领域，大肠埃希氏菌是我司众多优质细菌PCR检测试剂盒之一，质量堪比同类进口产品，价格非常优惠，目前正热烈促销中，恭候您的咨询订购。...

特别提示：包括大肠埃希氏菌(O157:H7)荧光定量PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：大肠埃希氏菌(O157:H7)荧光定量PCR检测试剂盒
英文名称：Escherichia coli O157:H7 qPCR Kit
产品货号：BTN11-710
产品规格：50次

大肠埃希氏菌，俗称大肠杆菌（Escherichia coli），属于革兰氏阴性细菌。大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)的zuì常见类型，O表示抗原类型, H7表示血清型。其感染剂量低，人体只要摄入10个细菌就可以致病，目前还没有疫苗，因此大量开展预防检测工作具有重要的意义。目前对O157的检测主要是传统分离培养、免疫学和分子水平的 PCR 检测。本试剂盒就是利用实时荧光定量 PCR技术开发的大肠杆菌 O157:H7检测试剂盒，它通过荧光染料实时显示样品模板DNA的量，并通过坐标曲线表示出来，结果直观准确。

产品特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。
2. 荧光定量PCR检测，反应特异性强。
3. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

产品组成：

组分	编号	规格(50T)
2×qPCR Mix	BTN90408	1mL
O157:H7专一性引物对	yw13851386	200 μL
O157:H7阳性对照，XXX 10E9拷贝/μL	yw13871388	100 μL
超纯水	BTN100935	1mL

保存条件：-20℃保存，有效期一年。

自备试剂：样品等

使用方法：
一、样品DNA的制备
用自选方法提取细菌样品DNA。注意：DNA纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品DNA，后面的PCR再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备O157:H7标准曲线（以10-10E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2和1号。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL超纯水（zuì好用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用TE缓冲液或超纯水10倍梯度稀释到10E7拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至10E7拷贝/μL，建议每次稀释10倍，梯度稀释至10E7拷贝/μL）。
4. 在6号管中加入5 μL 10E7拷贝/μL的O157:H7阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10E6拷贝/μL的阳性对照。
5. 换枪头，从6号管中取5 μL溶液到5号管中，充分震荡1分钟，得10E5拷贝/μL的阳性对照。
6. 换枪头，从5号管中取5 μL溶液到4号管中，重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。
7. NC管中不加任何阳性对照。
8. 从1-6号管中分别取5 μL和待测样品一起进行定量PCR（见下步），每个样品做3次重复。PCR后得到每个阳性对照稀释样品的荧光PCR Ct值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。
三、PCR检测（20μL体系）
1. 在PCR管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次）：

成份	样品	阴性对照	阳性对照
2×qPCR Mix	10 μL	10 μL	10 μL
待测样品DNA模板	1-5 μL	无	无
O157:H7阳性对照， XXX 10E9拷贝/μL	无	无	5uL(每个管加一个 稀释度的对照)
自备10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	2 μL
O157:H7专一性引物对	2 μL	2 μL	2 μL
补水到	20 μL

注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX。
2. 建议PCR反应参数（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）

过程	温度	时间
预变性	95℃	10分钟
PCR反应 (40个循环)	94℃	15s
	60℃	30s

3. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时，zuì大吸收光谱在471 nm，结合DNA时的zuì大吸收光谱在500 nm，zuì大发射光谱在530 nm。

四、数据处理
以O157:H7阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品浓度的log为横轴，以Ct值为纵轴，通过待测样品的Ct值计算出样品DNA的浓度。

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