JN0005 链cDNA合成试剂盒

我公司致力于为客户提供高纯度、低成本的活性重组蛋白，包括链cDNA合成试剂盒在内的各类受体、细胞因子、生长因子、转录因子、激素、酶、毒性蛋白、病毒抗原等。...

特别提示：包括链cDNA合成试剂盒(预混试剂)(去除基因组DNA)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：链cDNA合成试剂盒(预混试剂)(去除基因组DNA)
英文名称：Balbscript PreMix 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix
产品货号：JN0005
产品规格：50次|100次

  本试剂盒是以mRNA或者总RNA为模板，合成链cDNA。本产品含有反转录反应所需的全部试剂（Balbscript Reverse Transcriptase，RNase Inhibitor，Oligo(dT)18，Random N6，dNTPs），浓度为2×。反应时只需要加入RNA模板和水即可，操作简单，降低操作过程中的污染。本制品含有去除基因组的成分gDNA Purge，可以同步去除基因组DNA污染。反应结束后，85℃加热5秒钟，就可以失活反转录酶、RNA酶抑制剂以及gDNA Purge。合成的链cDNA能直接用于PCR或荧光定量PCR的模板以及第二链cDNA的合成或线性RNA扩增的模板，也可用于带有放射性或非放射性核苷酸标记链cDNA的实验。

试剂盒组成：

组份	JN0005-50次
2×BalbscriptR PreMix 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix	500μl
gDNA Purge	50μl
RNase Free Water	1ml

注意事项：
1、用DEPC处理实验用到的所有器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，整个实验过程需戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
2、确保所用试剂中无RNA酶污染。
3、试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管盖要确保扣严。
4、纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀法去除痕量污染物。

实验步骤：

链cDNA合成:
1、融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
2、按顺序加入下面的反应物

模板RNA	总RNA(0.1 ng -5μg) poly(A) mRNA(10 pg) 特异性RNA(0.01 pg)
2×Balbscript PreMix UltraMix	10μl
gDNA Purge	1μl
RNase Free Water	至20μl

3、可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将RNA模板和RNase Free Water混匀后，65℃孵育5分钟，冰上冷却后再加入其它组分。
4、轻柔混匀后离心，于42℃条件下孵育60分钟。 如果RNA模板中不含poly A结构，可先在25℃条件下孵育5分钟，随后转到42℃条件下孵育60分钟。
5、70℃加热5min终止反应。
反应产物可直接用于PCR反应，如果不立即使用，在-20℃可保存一周左右。如想延长保存时间，建议使用-70℃保存。

链cDNA的PCR扩增:
合成的链cDNA可直接用于PCR或qPCR。链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中，链cDNA反应液加入2μl。

储存条件：-20℃

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名称：Pfu DNA Polymerase
货号：WE0107
规格：500U
  Pfu DNA Polymerase是通过大肠杆菌表达纯化的重组酶，具有5"-3"DNA聚合酶活性和5"-3"外切核酸酶活性的同时具有3"-5"外切核酸酶活性，因此在DNA扩增过程中具有纠错能力，是目前发现的错配率zuì低的耐高温DNA Polymerase。该酶与Taq DNA Polymerase相比具有更好的热稳定性，对于高GC含量模板，提高变性温度对它活性无影响。使用本产品扩增得到的PCR产物的3"端不带有“A”碱基，不能直接用于T/A克隆，如需进行T/A克隆则需要在其末端添加“A”或用平末端载体进行克隆。本产品适用于基因克隆、基因定点突变、SNP和末端补平等实验。

产品组成：

组份	500U
Pfu DNA Polymerase, 5 U/μl	100μl
10×PCR Buffer	1.8ml

注意：本产品的10×PCR Buffer中含有15 mM镁离子。

活性定义：
用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃，30分钟内，将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸性不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位(U)。

质量控制：
1、经过多次柱纯化，SDS-PAGE检测其纯度大于99%；
2、经检测无外源核酸酶活性；
3、PCR方法检测无宿主残余DNA；
4、能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；
5、室温存放一个月，无明显活性改变。

使用方法：
以下举例为以人基因组DNA为模板，扩增1 kb的片段的PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
10×PCR Buffer	5μl	1×
dNTP Mix，10 mM each	1μl	200μM each
Forward Primer，10μM	2μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	2μl	0.4μM
Template DNA	<0.5μg	<0.5μg/50μl
Pfu DNA Polymerase, 5 U/μl	0.5μl	2.5 U/50μl
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)用Pfu酶扩增时，引物的纯度要求较高，引物长度大于18个碱基，引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
2)Pfu酶3"-5"外切酶活性可能降解引物，所以应先加dNTP后，再加Pfu酶到反应体系中，并立即进行PCR反应。

2、PCR反应条件

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	2 min
变性	94℃	30 s	25-35 个循环
退火	55-65℃	30 s
延伸	72℃	60 s
终延伸	72℃	5 min

注意：
1)Pfu酶的热稳定性比Taq酶好，对于GC含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃，对Pfu酶的活性无影响。
2)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
3)Pfu酶具有3"-5"外切酶活性，所以Pfu酶扩增时延伸速度远比Taq酶低，延伸时间根据所扩增片段大小设定，本产品的扩增延伸速率为1 kb/min。
4)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。
5)本产品具有3"-5"外切核酸酶活性，PCR产物3’端不带“A”,不能直接用于T/A克隆，如需进行T/A克隆则需要在其末端添加“A”或用平末端载体进行克隆。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。

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