BTN91202 双酶一管式RT-PCR试剂盒
产品简介
北京百奥莱博供应的双酶一管式RT-PCR试剂盒用于科学研究,我公司的双酶一管式RT-PCR试剂盒品质上佳,经过多年的开发生产,已然非常成熟,欢迎广大新老客户订购。...
产品详细介绍
特别提示:包括双酶一管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:双酶一管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)
英文名称:Two-Enzyme One-Tube RT-PCR Kit
产品货号:BTN91202
产品规格:50次
本产品是经过精心优化的、基于MMLV 逆转录酶和Taq DNA聚合酶的双酶一管式RT-PCR试剂盒,它含有除模版RNA和其专一性引物以外的所有RT-PCR试剂,包括MMLV 逆转录酶、Taq DNA聚合酶、RT-PCR缓冲液等,可以在同一反应管内完成RNA→cDNA→PCR反应(RT-PCR反应)。
产品特点:
1.一管式完成RT-PCR反应,避免样品交叉污染。
2. 即开即用,用户不需要单独准备RT-PCR所需的各种试剂。
3. 主要成分只有两个RT-PCR buffer和MMLV-Taq Mix,将加样步骤减少到zuì低,大降低了加样误差,增加了可重复性。
4. 使用范围广,适用于从病毒RNA 到人RNA的各种RNA 模板。
5.高灵敏度,每个RT-PCR 体系zuì低可以检测200拷贝的RNA分子,可扩增的模版RNA的zuì长达2000nt。
6. 所得RT-PCR产物可以直接用于AT克隆。
试剂盒组成:
成分 | 规格 |
双酶一管式RT-PCR Buffer(2×) | 750μl |
MMLV-Taq Mix | 100μl |
RNase-free水 | 1ml |
说明书 | 1份 |
储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期一年。
使用方法:
注意:所有离心管用前zuì好全部短暂离心几秒使管壁上溶液沉淀到管底。下面以一个30μL 体系的RT-PCR 为例,如果体积不同,各成分用量需要适当调节。
1.在一干净的无RNase的PCR管中,先加入下列成分:
成分 | 阴性对照 | 样品 |
RNA模板(自备,分下面三种情况) | 无 | 见下 |
总RNA | 无 | 100-500ng |
或poly(A)mRNA | 无 | 10-500ng |
或体外转录得到的专一RNA | 无 | 0.01 pg-500ng |
RNA特异性引物一(自备) | 终浓度300nM | 终浓度300nM |
RNA特异性引物二(自备) | 终浓度300nM | 终浓度300nM |
探针(仅对Realtime RT-PCR) | 终浓度200nM | 终浓度200nM |
RNase-free水 | 补到13μL | 补到13μL |
双酶一管式RT-PCR Buffer(2×) | 15μl | 15μl |
MMLV-Taq Mix | 2μl | 2μl |
注:通常初次使用本试剂时,可用引物浓度300nM,探针浓度200nM进行实验,根据实验结果具体情况,在200~800nM 范围内调整引物浓度,在50~400nM 范围内调整探针浓度以达到zuì佳检测效果。引物、探针、待检样品的具体加量用户可以根据实际情况调整,同时增减DEPC 水用量,保证总反应体积不变即可。
2. 轻柔混合均匀后放入PCR 仪中进行RT-PCR。
3. 设定RT-PCR反应条件时,一般将RT的条件设定成42℃,30 钟,后接94℃变性5分钟,然后进入PCR循环(PCR参数将根据自备引物的Tm 值由用户自行决定注)、zuì后72℃,5分钟。对Realtime PCR,在复性步骤设置荧光检测,检测通道:FAM/HEX/VIC/ROX/CY5
4. RT-PCR结束后取5-10μL电泳检查。
注意事项:
1. 使用已校准的移液器,选用一次性PCR反应管、离心管、tip 头等进行样本处理及配液等操作,所有用具应不含DNA酶和RNA酶。
2.引物、探针设计过程中应尽可能避免发夹结构、二聚体等现象的发生,探针的位置尽可能靠近上游引物,PCR 目标片段zuì好小于200bp,尽可能在150bp以内。
3. 实验样品尽可能新鲜,提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA 降解。
4. 使用本产品时建议对RT-PCR扩增条件、引物浓度和样品用量进行调整,选择zuì适当的引物浓度、样品浓度和PCR扩增条件。
5. 本产品使用前应在室温充分融解,并用漩涡震荡器充分混匀。
6. 统一配液后分装以减少加样误差,每次实验应设置阴性对照。
7. 禁止标记PCR反应管,避免外源性荧光信号干扰。
8. PCR反应管中不能有气泡,否则会产生非特异的荧光信号。若有气泡,可先用手指将气泡弹破,然后再低速离心消除。
9. 实时荧光PCR 仪器连续进行实验时,zuì好间隔一小时以上再使用。
10. 实时荧光PCR 仪需经常校正和清洁载样板板孔。
11. 若使用Roch LightCyclerTM荧光PCR 仪,应将毛细管放在专门套管中,以便分装反应体系和加入待检样品。前述操作完毕应低速离心数秒再将毛细管垂直缓慢放入样品架,以免折断;若发生折断,应小心取出,用专用小毛刷擦拭干净后方可进行扩增。
12. 实验室应严格分区,避免PCR产物污染。
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货号 | 名称 | 规格 |
BTN91202 | 双酶一管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq) | 50次 |
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货号:BTN80205
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大量实验显示5-10%的DMSO能够促进PCR反应,尤其是高GC模板的PCR反应,本产品就是专门用于PCR或RT-PCR的高纯度DMSO。
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货号:BTN130840
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本产品为专门用于PCR的MgSO4溶液,浓度10mM,可以用于调节MgSO4的zuì佳浓度。MgSO4为常用的PCR增强剂之一。
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名称:25mM氯化锰溶液(PCR级MnCl2溶液)
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本产品为专门用于易错PCR的MnCl2水溶液,浓度为25mM,可用于调节MnCl2的zuì佳浓度。由于Mg2+在PCR过程中可以稳定非互补的碱基对,Mn2+能够降低聚合酶对模板的特异性,因而调整两种离子的浓度,可获得不同突变频率的多样性文库。
氯化锰分子量为125.8,CAS号为7773-01-5,水合氯化锰外观为玫瑰色单斜晶体;无水氯化锰外观为桃红色结晶。密度为2.977g/cm3。熔点是650℃。在高于熔点温度下升华。沸点1190℃。易溶于水,溶于醇,不溶于醚。
储存条件:低温运输、-20℃保存,有效期一年。
名称:即用型高保真PCR试剂盒
货号:BTN90708
规格:1.5mL
本产品是即用型的2×高保真PCR预配反应液,含有除引物、模板以外的所有PCR试剂,包括Pfu DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂、上样染料等,特别适合于高保真PCR反应。
产品特点:
1. Pfu DNA聚合酶是使用zuì广泛的高保真酶,其保真度为普通Taq酶的10倍。
2. 使用时只需在加入模板和引物并稀释到1倍浓度即可进行PCR反应,非常方便,简化了PCR的准备工作。
3. PCR反应所必需试剂全集于一管之中,数分钟即可完成反应体系配置。由于加样过程少,有利于减少污染,降低实验误差。
4. 本产品A型含电泳染料,PCR反应液可直接上样电泳,进一步简化了操作。
5. 由于各成分的浓度和比例都经过精心优化,反应的灵敏度高,特异性强。
6.适用于基因的高保真扩增和基因定点突变等实验,得到的PCR产物可用于平末端克隆。
储存条件:低温运输,-20℃保存,保存期限为12个月。
使用方法:
将本产品与用户自备的模板,引物混合液按下列推荐使用量(30μL反应体系)加入PCR 管中即可进行PCR,反应结束后直接取5-15μL电泳检查扩增结果。如果反应体系不是30μL,各成分需要按比例增加或减少。
试剂 | 加入量 | |
2×高保真PCR MagicMix | 25μL | |
DNA模板(自备) | 哺乳动物基因组DNA | 0.5-1μg |
酵母基因组DNA | 5-500ng | |
细菌基因组DNA | 0.5-50ng | |
质粒DNA | 5-500ng | |
PCR回收片段 | 1-100pg | |
PCR引物(自备) | 10-20pmol each | |
补水到 | 30μL |
参考扩增条件:
预变性 | 94℃ | 4min |
PCR(30个循环) | 94℃ | 30s |
50℃ | 30s | |
68℃ | 0.5kb/min | |
延伸 | 68℃ | 10min |
注意事项:
1. 本产品的Pfu DNA聚合酶比Taq DNA聚合酶的延伸反应速率低,因此我们推荐的扩增延伸反应时间为每kb 需2 分种。
2. Pfu酶3′-5′外切酶活性可降解引物,所以强烈建议在冰上配置完成PCR反应液后,立即放入PCR 仪中进行扩增,扩增完毕后立即进行电泳检测。
3. 本产品扩增产物为平末端,不可以直接进行TA 克隆,可以使用ClionB载体(BTN51104)进行克隆。如需要进行TA克隆,建议对PCR产物纯化后,用加A 试剂盒(BTN60105)加A后再进行TA克隆。
4. 由于Pfu 无 5′到 3′外切酶的活性,所以本试剂盒不能用于实时荧光PCR。
疑难解答:
Q:为何Pfu DNA Polymerase扩增效率不如Taq DNA Polymerase?
A:一是由于Pfu DNA Polymerase 具有3′-5′的外切活性,所以在合成过程中,该酶会随时校对新添加的核苷酸是否配对,影响了合成效率;二是它能通过3′-5′的外切活性使引物部分降解,降低引物结合模板的能力,进而影响扩增效率。三是上面提到的尿嘧叮抑制作用。
Q:使用本产品时还有哪些注意事项?
A:1.引物长度和浓度一般应比常规的PCR 长和高(考虑到被Pfu DNA Polymerase的3′-5′的外切活性降解的因素);
2.zuì好在反应前加Pfu DNA Polymerase。
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