ZN1522 敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅳ

北京百奥莱博供应的敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅳ用于科学研究，本产品质量好，且具价格，深为用户称道，了解更多敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅳ等探针标记及检测产品请联系我司咨询订购。...

特别提示：包括敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅳ(CY3)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅳ(CY3)
产品货号：ZN1522
产品规格：100T

保存：置4℃。
工作量：100 张切片。
有效期：一年。
所谓原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具，其作用是免疫组化所无法代替的。 具有敏感性特高，操作简便和结果准确的优点。该试剂盒用于 mRNA的杂交，不推荐使用每个探针分子仅标记一个地高xīn的寡核苷酸探针。
如果使用 cDNA 探针，应在杂交之前变性探针。
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2．预杂交液 2ml；
3.寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml;
5.生物素化鼠抗地高xīn 5ml;
6．SABC-CY3 100ul(1:100)
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,0.5M PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml 蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,pH2.0左右。
2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O，分子量 294)8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸馏水加 100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸馏水加 30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。
0.5 M PBS——1000ml 蒸馏水加氯化钠 30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g,PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入 0.1%的DEPC 处理，以抑制 RNA酶对 mRNA的分解作用.
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度 10-20μM。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和 5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后 0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS，含有 1/1000 DEPC。
室温固 定 20--30分钟。蒸馏水洗，干燥后可-20℃冰冻保存 2 周。
4．暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加 2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化 5—120 秒钟。有时也可以不消化。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
5．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持湿度。按每张切片 20μl加预杂交液。恒温箱 37-40℃2—4 小时。吸取多余液体，不洗。
6．杂交——用杂交液稀释地高xīn标记的寡核苷酸探针，浓度一般 0.5-2μg/ml。按每张切片加20μ ι 杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱 37—40℃杂交过夜。
7．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，30—37℃左右水温的2×SSC洗涤 5分钟×2次；0.5×SSC洗涤15分钟×1次；0.2×SSC洗涤 15分钟×1次。必要时可重复 0.2×SSC洗涤 1次。
8.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
9.滴加生物素化鼠抗地高xīn：37℃60或室温 120分钟。0.5M PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
10．滴加 SABC-cy3：取 1ul SABC–FITC 加原位杂交用 PBS 100ul,每张切片加 50ul 37℃ 30分钟。0.5M PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
11．用水溶性封片剂或抗荧光衰减封片剂 封片后，荧光显微镜观察。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 MPBS，含有 1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过 4mm的小块，固定 1 小时即可，较大的标本固定不要超过 2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一定不要超过 1 小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片常规脱蜡至水。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加 2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化 3--30分钟(视标本厚薄、新旧自行调整)。充分的消化可以使mRNA得到暴露，从而增强杂交信号；但另一方面，过度的消化又使切片明显减薄乃至消失，从而失去杂交信号。由于用户的切片情况各不相同，这就需要用户比较不同的消化时间，例如 10分钟，20分钟，30分钟，以找到zuì佳的消化时间。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
其余步骤和冰冻切片5-11步相同。
结果观察：
阳性细胞的胞浆着色呈黄绿色荧光。
注意事项：
如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。有其它明显的非特异性染色现象时，可以用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—5倍。

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名称：5′末端同位素标记试剂盒
货号：BTN131036
规格：20次
本产品为DNA 5′末端标记系统，利用T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶)和［γ-32P］ATP 对粘性末端或平末端的DNA或RNA的5′末端进行标记反应。原理如下：


产品特点：
1. 使用本试剂盒之前，不需要对 5′末端的磷酸基团进行去磷酸化处理，因为使用的kinase 能使5′末端的磷酸与[γ-32P]ATP的γ-磷酸进行交换。
2. 合成的单链或双寡核苷酸的5′末端游离的OH基团都能通过Kinase反应被标记(或者只是简单的磷酸化)。
3. 提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能进行，均能得到大于106 cpm/pmol(5′-end)的比活性。

试剂盒组份：

成分	规格
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	20μl
5×交换反应缓冲液	100μl
10×磷酸缓冲液	50μl
Control DNA	20μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、交换反应
1. 实验前需自备的试剂：7 M 醋酸铵、乙醇、70%乙醇等
2.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的5′磷酸化DNA片段	14μL(≤5 pmoles的5′末端)
5×交换反应缓冲液	5μL
[γ-32P]ATP	5μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

注：5 pmoles的5′末端约等于0.17μg的长100bp的双链DNA。
3. 37℃反应30分钟。
4. 70℃加热5～10分钟使酶失活。
5. 加入10μl的7 M CH3COONH4(pH4.5)。如使用CH3COONa做乙醇沉淀时使其终浓度达300mM。
6. 加入87.5μl(2.5倍)的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
7.离心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用适当 Buffer 溶解沉淀。
注：通过第5～8 步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P] ATP，如要完全将其除去时，乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白质时，请在第8 步之后进行。

二、磷酸化反应标记

A. 去磷酸化反应
1. 实验前需自备的试剂：TE 饱和酚/氯fǎng、3 M NaCl 、乙醇、70%乙醇、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)等
2.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的DNA片段	133μL(≤10μg)
1M Tris-HCl，pH8.0	15μL
牛小肠碱性磷酸酶(CIAP，10～20U/μL)	2μl
灭菌的超纯水	补足到150μL

3. 50℃反应30分钟。
4. 加入150μl的TE 饱和酚/氯fǎng/异戊醇(25：24：1)，充分混匀。
5.离心，取上层(水层)移到另一个微量离心管中。
6. 重复操作 4～5。
7. 加入7.5μl的3 M NaCl(zuì终浓度150mM)。
8. 加入375μl(2.5倍量)的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
9.离心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20μl的TE Buffer 溶解沉淀。

B. 磷酸化反应(前反应)
1.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的DNA片段	20.5μL(≤5 pmoles的5′末端)
10×磷酸缓冲液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

2. 37℃反应30分钟。
3.下面的操作与交换反应的第4-8 步操作相同。

三、合成DNA 寡核苷酸的标记
1.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
Oligonucleotide DNA with free 5′-OH(5～10 pmoles)	≤3μL
10×磷酸缓冲液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

2. 37℃反应30分钟。
3.下面的操作与交换反应的第4-8 步操作相同。

四、合成DNA 寡核苷酸的标记
当掺入水平很低的时候，需要使用本步骤，即通过体积排阻色谱或过滤试剂盒除去未反应的标记。Sephadex G-50 层析柱(需另购)对于去除未掺入的dNTPs效果很好，它还能大幅减少小于20个碱基的DNA 寡核苷酸和小于20bp的双链DNA的量。使用之前需要在70℃加热5～10分钟以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 层析柱可以用来纯化长度不小于10个碱基的寡核苷酸。

注意事项：
1.缓冲液可在室温融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混匀。
2. 5×交换反应缓冲液于-20℃冻结保存时会有白色浑浊出现，但不影响反应效果。
3.酶切得到的DNA片段需经乙醇沉淀等方法纯化。
4. 当用于交换反应的DNA在5 pmoles以上(约1,000bp以上)时，标记效率有时会低于106 cpm/pmol。
5. 如果交换反应所用 DNA低于500bp时，标记效率有时会有所降低。
6. 若不进行放射线标记，仅使用本试剂盒做5′末端磷酸化反应时，反应体系中的［γ-32P］ATP可用5μl的10mM ATP 代替。
7. 磷酸化反应时的［γ-32P］ATP可用［γ-35S］ATP 替代。

使用举例：
按照使用方法中交换反应和合成DNA 寡核苷酸的标记的实验操作，取λ-BstP I，λ-Hpa I，λ-EcoT22 I 各3 pmols，用［γ-32 P］ATP 通过正向磷酸化反应或交换反应标记。各DNA片段的放射自显影结果如下所示：


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