HR8285 Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒

本试剂盒可以方便快捷的检测凋亡细胞,使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。...

Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒

 

产品编号：HR8285

产品组成：

储存条件：

染色液2-8℃避光保存；结合液2-8℃保存。有效期1年。

【注】：

● Annexin V-APC染色液长期不用-20℃保存,避免反复冻融,冻融会导致失效。

● Annexin V-APC染色液需长期保存时,可根据用量进行分装后-20℃保存。

产品简介：

本试剂盒将Annexin Ⅴ与7-AAD匹配使用,可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与Annexin V-APC和7-AAD结合显色,而7-AAD则被排除在活细胞(APC阴性)和早期凋亡细胞(APC阳性)之外。在没有巨噬细胞的情况下,凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体,从而使凋亡晚期的细胞也同时被APC和7-AAD结合染色呈现双阳性。

本试剂盒可以方便快捷的检测凋亡细胞,使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。

Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒产品特点：

● 方便：可用流式细胞仪或荧光显微镜检测；

● 快速：1小时内即可完成实验；

● 准确：能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞,并计数各群细胞的比例。

检测方法：

● 流式细胞仪 ● 荧光显微镜 ● 激光共聚焦

样本类型：

● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞

试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：

●流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦 ●离心机 ●移液器 ●PBS或者HBSS

使用注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体收集至管底,避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。

● 细胞处理需小心操作,尽量避免人为损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小,重悬细胞是动作要轻柔,避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。

● Annexin V-APC和7-AAD是光敏物质,在操作时请注意避光,尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。

● 由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程,因此最好在染色后立即进行分析。

● 使用Annexin V-APC试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不要固定细胞,固定操作会对结果产生干扰。

● 如果细胞样品中含有血小板,如血液样品,请使用含有EDTA的缓冲剂并200g 离心洗去血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合。

● 流式细胞仪检测时,细胞数量应不低于1×10⁵。

● 如果细胞收集过程中使用了胰酶,需注意用PBS洗净去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-APC,最终导致染色失败。

● 贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。中晚期凋亡细胞失去贴壁能力而漂浮于培养基,此部分细胞对结果有显著影响,不可随意丢弃,需离心后收集与贴壁细胞一起检测,才能全面的反映出细胞凋亡的整体情况；

● 对于贴壁细胞,消化是个关键步骤。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞,胰酶消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,7-AAD摄入过多；消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-APC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后,轻摇使胰酶与细胞充分接触,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余的少量胰酶再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA,EDTA影响Annexin V与PS的结合。

● 成功的检测凋亡受以下几种因素的影响,如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS 翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间以及实验过程中机械损伤的程度等,把这些影响因素进行优化对实验成功与否至关重要。务必根据每次实验样本类型和操作流程对这些步骤进行优化。

● 在进行流式细胞仪检测之前,事先进行显微镜观察有好处。

● 有极少数细胞株其细胞膜上PS密度很低,难以染色,此时不适合用Annexin V 方法检测凋亡。

使用方法：

样品染色：

1、离心收集悬浮细胞。离心机300-500g力,2-8℃,离心时间5分钟,弃培养基。

【注】：

● 对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞,至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。

● 贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心,收集细胞。胰酶消化时间不宜过长,以防损伤细胞膜,引起假阳性。

● 检测贴壁细胞时,胰酶消化前,去掉的上清也要保留,因为可能存在一些掉下来的凋亡细胞,在胰酶消化后,再将这些上清加回去,一起离心后收集检测,结果更加准确。

● 对于特定的细胞,如果细胞无法完全离心至离心管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

● 离心转速根据平时该细胞实验时的转速即可。

● 离心后小心吸除上清,可以残留约50μL左右的液体,以避免吸走细胞。加入约1mL 4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。

2、用冷PBS洗涤细胞两次。(300g-400g,2-8℃,离心时间5分钟收集细胞)。

3、用100μL 1×Annexin V结合液悬浮细胞,浓度大约为1-5×10⁶cells/mL。

4、在细胞悬浮液中加入5μL Annexin V-APC染色液,轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育5-10分钟。

5、加入5μL 7-AAD染色液后轻轻混匀于2-8℃ 避光条件下孵育1-3分钟。

6、加入400μL PBS或1×Annexin V结合液,轻轻混匀。

7、立即用流式细胞仪检测。

【注】：

● 染色完成后要尽快上机检测,因为细胞在Annexin V结合缓冲液中存活时间不会太长。

Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒流式细胞仪分析：

经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。按常规流式凋亡检测操作即可。

Annexin V-APC的荧光最大激发波长652nm,最大发射波长670nm；7-AAD 荧光最大激发波长550nm,最大发射波长在647nm。

上机检测前,须用待测细胞制备质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：

(I)未转染GFP等标记的细胞

① 空白管：阴性对照组细胞,没有染色的细胞。不加Annexin V/APC,7-AAD。用于调节电压。

② 单染管：有明显凋亡的细胞,只加Annexin V/APC染色。用于调节补偿。

③ 单染管：有明显凋亡的细胞,只加7-AAD染色。用于调节补偿

④ 检测管：待测的处理细胞,加Annexin V/APC,7-AAD。用空白管和单阳管调节好电压补偿后,获得所需要的流式数据。

(II)转染GFP细胞

① 未转染空白管：未转染细胞,阴性对照组细胞,没有染色的细胞。不加Annexin V/APC,7-AAD。用于调节电压。

② 转染GFP空白管：转染GFP的对照组细胞,没有染色的细胞。不加Annexin V/APC,7-AAD。用于调补偿。

③ 未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞,只加Annexin V/APC染色。用于调节补偿。

④ 未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞,只加7-AAD染色。用于调节补偿。

⑤ 检测管：待测的处理细胞,加Annexin V/APC,7-AAD。用空白管和单阳管调节好电压补偿后,获得所需要的流式数据。

【注】：

● 具体流式设置按常规方法即可。参照流式细胞仪说明书或咨询仪器技术支持。

常见问题分析：

实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。

● 确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。

● 贴壁细胞消化不当。Annexin V跟PS的结合需要Ca²⁺离子,结合液中含有Ca²⁺,

EDTA的消化会影响染色,建议使用无EDTA的胰酶,或者消化后用PBS洗涤干净。

● 细胞离心用冷PBS 洗涤后,应尽量吸干残余液体,残余过多的PBS 中含有磷酸根,会形成磷酸钙沉淀,影响Annexin V的染色。

● Annexin V结合液瓶盖要盖紧密封,长时间暴露于空气后,空气中的CO₂进入后形成CaCO₃会产生沉淀,从而减少游离的Ca²⁺,导致实验的结果不佳。

● 污染其他的缓冲液。如吸取PBS 后不更换Tip头会导致游离的Ca²⁺的减少,从而导致实验的结果不佳。

● 阳性细胞的丢失。如果是贴壁细胞,药物诱导后漂浮的细胞要收集起来合并检测,这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞,丢弃会造成阳性结果偏低。

实验过程中阳性率偏高。

● 细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/7-AAD+双阳性的细胞比例过高,造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力,台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力偏低低,建议重新复苏细胞,通常刚复苏的细胞至少要传代3次

以后才能进行实验。

● 细胞操作不当。贴壁细胞消化过程中反复剧烈吹打导致细胞膜破坏,使得假阳性偏高。细胞洗涤、重悬等过程过于剧烈导致细胞膜损伤。Annexin V-APC会进入损伤的细胞膜,在细胞膜内部染色。

● 凋亡诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡,因此通常不需要处理大于48小时以上,诱导时间过长会使营养物质耗尽,导致细胞状态差,假阳性结果偏高。

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