HR8823 冰冻切片活性氧(ROS)检测试剂盒

切片样本的活性氧检测一般最好使用振动切片或者新鲜的冰冻切片样本。石蜡切片样本的ROS在石蜡切片的的制作过程中会损失掉，有条件的话就使用振动切片或者冰冻切片样本，一般不建议使用石蜡切片样本。已经制备好的石蜡切片样本中残余的ROS也可以用本试剂盒检测。有条件的话也可以采用直接用新鲜组织样本检测，不需要制备成切...

冰冻切片活性氧(ROS)检测试剂盒

 

产品编号：HR8823

产品组成：

储存条件：

探针-20℃避光保存；清洗液2-8℃保存。有效期1年。

【注】：

● 探针长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。

● 探针液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

冰冻切片活性氧(ROS)检测试剂盒产品简介：

组织切片活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针O11进行活性氧检测的试剂盒。

O11是一种细胞膜通透性的荧光探针，O11本身荧光极低，被活性氧特异性氧化生成绿色荧光物质，绿色荧光强度与活性氧水平成正比，检测绿色荧光强度就可以知道组织内活性氧的水平。

在激发波长500nm，发射波长525nm附近，使用激光共聚焦/荧光显微镜检测绿色荧光强度，从而测定组织内活性氧水平。利用本试剂盒可以快速定性检测样本内活性氧水平变化差异。

切片样本的活性氧检测一般最好使用振动切片或者新鲜的冰冻切片样本。石蜡切片样本的ROS在石蜡切片的的制作过程中会损失掉，有条件的话就使用振动切片或者冰冻切片样本，一般不建议使用石蜡切片样本。已经制备好的石蜡切片样本中残余的ROS也可以用本试剂盒检测。有条件的话也可以采用直接用新鲜组织样本检测，不需要制备成切片的ROS检测试剂盒（相关产品：HR8835）。

产品特点：

● 使用方便：可用荧光显微镜直接观察；

● 背景低，灵敏度高；

● 线性范围宽，使用方便。

检测方法：

● 荧光显微镜 ● 激光共聚焦显微镜

样本类型：

● 新鲜冰冻切片 ● 振动切片 ● 石蜡切片

试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：

● 荧光显微镜/激光共聚焦显微镜 ● 移液器 ● PBS缓冲液或HBSS(无酚红)

使用注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

● 对于某些样本，如果荧光太强，可以按照1:200-1:1000 稀释探针。探针标记的时间也可以根据情况在20-60分钟内适当进行调整。

● 冰冻切片制作不需要经过固定脱水包埋等步骤，直接冷冻后切片贴片。

● 有条件也可采用振动切片的方法。有些方便处理的样品类型也可采用徒手切片。

● 以下操作步骤仅供参考，请根据实际样本情况调整。

冰冻切片活性氧(ROS)检测试剂盒使用方法：

一、 试剂配制

1、根据样本数，用纯水将O11活性氧荧光探针200倍稀释，配成染色工作液。

【注】：

● 不可以一次性将探针全部稀释。现配现用。

● 不同样本的ROS差异较大，需要根据预实验结果调整探针用量。一般染色终浓度按试剂盒中探针母液的200-1000倍稀释，200倍稀释适合大多数样本。

● 如果荧光强度太强，可以增加稀释倍数。

● O11探针液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

● 微量操作时，注意探针要有效加入匀浆液，避免没有加入。

● 以下步骤使用的O11探针为此步骤稀释过的探针。

2、用纯水将10×清洗液10倍稀释，配成1×清洗液工作液。

二、 探针标记

1、准备待测的厚为10-20μm的未经固定处理的冰冻切片。

【注】：

● 必须使用新鲜组织（手术切除后1小时内）制成的冰冻切片/振动切片。

● 否则不新鲜的样本可能ROS已经流失，检测不到活性氧。

● 非新鲜样本残余的ROS也可以检测到。

2、室温下，小心加上200μL清洗液工作液，铺满整个切片表面，静置5-10 分钟。

3、小心吸除清洗液。

4、滴加100μL染色工作液，在37℃培养箱避光孵育20-60分钟。

【注】：

● 最好在湿盒中孵育，避免液体蒸发。

5、移除染色液。

6、用PBS洗涤切片2-3次。

7、加盖玻片或甘油封片。

8、荧光显微镜检测。

【注】：

● 染色完成后，立即进行荧光定性分析。

● 激发波长488 nm，发射波长525 nm。

● 荧光强，表明活性氧（ROS）含量高。

● 拍照后，用相应的图像分析软件进行光密度分析。可以用实验中对照样本的荧光强度值为基准，待测组样本的荧光强度值占对照样本的百分比来比较活性氧（ROS）程度差异。

常见问题分析：

● 活性氧结果如何分析？

ROS是多种物质的统称，不像某一单一活性氧指标，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其ROS的变化，测定其ROS是增加或者降低了。

● 荧光照片如何分析？

需要有相关的荧光强度分析软件。ROS表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。

有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度，可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能，可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标进行分析。

要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野找。

如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，作分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。

为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。

对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。

要根据课题需要选择合适的测量统计方法。

● 荧光照片效果不好？

荧光拍照存在很多变量，每一个变量都会严重影响拍照效果。

荧光拍摄条件：拍摄环境、显微镜品牌和激发荧光决定了镜下观察的效果。同样的操作方法和切片，在不同品牌显微镜下显示出完全不同的荧光强度。

荧光衰减：荧光物质的衰减通常都是非常明显的。同样的一组切片，1小时内拍摄和8小时后拍摄，荧光效果完全不同。

最好用激光共聚焦显微镜，激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，通常同一张片子激光共聚焦的效果明显更优。

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