HR8791 活性氮(RNS)检测试剂盒

活性氮检测试剂具有高的灵敏度,良好的选择性,短的响应时间,以及可对检测对象在原位进行实时监控和观察等。更重要的是,这种检测技术对细胞内活性氮的内源性分布不产生巨大的外加干扰,从而能最大程度地得到内源性活性氮变化的真实信息。...

活性氮(RNS)检测试剂盒

 

产品编号：HR8791

产品组成：

储存条件：

-20℃避光保存,避免反复冻融。有效期1年。

【注】

● 染料长期不用可以-20℃保存,避免反复冻融。

● 染色探针A为DMSO溶液,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,变成液体状态后离心至管底部再开盖。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热,否则容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

活性氮(RNS)检测试剂盒产品简介：

活性氮(reactive nitrogen species,RNS)是指NO与包括活性氧在内的化合物相互作用,生成一系列包括ONOO·及其质子形式过氧亚硝酸(HOONO)等具有高度氧化活性的自由基和硝基类化合物,这些与活性氧相对应的以NO 为中心的衍生物称为活性氮。活性氮主要包括氮氧化物一氧化氮(NO)和二氧化氮(NO2)、过氧化亚硝酰阴离子(ONOO·)、亚硝酰氢(HNO)、亚硝酸根离子(NO2-)和氨等。

活性氮检测试剂盒是一种利用荧光探针O52进行活性氮检测的试剂盒。O52探针本身荧光很弱,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成O52D。而O52D不能通透细胞膜,从而使探针很容易被标记到细胞内。

在活性氮存在的条件下,O52D与活性氮反应生成强荧光物质O52F,O52F发出的绿色荧光强度与细胞内活性氮水平成正比,检测O52F的荧光就可以知道细胞内活性氮的水平。O52F的荧光最大激发波长是490nm,最大发射波长是516nm。

活性氮检测试剂具有高的灵敏度,良好的选择性,短的响应时间,以及可对检测对象在原位进行实时监控和观察等。更重要的是,这种检测技术对细胞内活性氮的内源性分布不产生巨大的外加干扰,从而能最大程度地得到内源性活性氮变化的真实信息。

在激发波长488 nm,发射波长516nm附近,使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测O52F荧光,从而测定细胞内活性氮水平。

本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。

产品特点：

● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；

● 背景低,灵敏度高；

● 线性范围宽,使用方便。

检测方法：

●荧光分光光度计 ● 荧光酶标仪 ● 流式细胞仪 ● 荧光显微镜 ● 激光共聚焦

样本类型：

● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器：

● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪,激发波长490±10 nm,发射波长510 ±10 nm,或者按照FITC荧光检测条件检测。

● PBS ● HBSS(不含酚红) ● 移液器 ● 离心机 ● 荧光专用黑色96孔板

活性氮(RNS)检测试剂盒使用注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体收集至管底,避免开盖时液体洒落。

● 荧光探针标记后,一定要洗净残余未进入细胞内的探针,否则导致背景较高。

● 探针标记完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的标记情况是否正常。

● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。

● O52染色液为DMSO溶液,冬季气温较低时在室温时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解,吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

● 使用前,先将本品回温至室温,并对其进行简短离心使DMSO 溶液集中于管底。

● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

● 标记的条件因细胞种类而异,根据不同样本的实际染色结果做相应调整,在每次实验前,请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化,确定最佳条件。以下方法仅供参考。

● 酚红对O52荧光探针的检测有干扰,需避免。

● 染色后立即进行分析。

● 以下步骤仅做为参考,稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如,对于某些细胞,如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强,可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱,可升高O52探针浓度,以提高检测的灵敏度。另外,探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整,孵育温度在4℃-37℃内调整。

● 必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

使用方法：

1、探针染色工作液配制：

根据样本数量,用HBSS将O52荧光染料100倍稀释,配制成染色工作液。

【注】:

● 建议收到产品后,根据单次使用量,对母液进行小量分装,每次使用一管,试剂-20℃避光冻存,一年稳定。

● 实验前,使用HBSS或PBS稀释储存液到需要的工作浓度。工作浓度为根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度,一般染色终浓度100-1000倍稀释。

● 可以用无血清的培养基稀释探针,不可以用含血清的培养基稀释。

● 为了降低过度加载染料导致的潜在背景和线粒体毒性,在不影响实验结果的前提下应尽可能低浓度染色。另外,浓度过高也可能造成非特异性染色,对其他细胞结构进行染色。

● 工作液现配现用。

2、细胞探针标记

2.1 原位标记：仅适用于贴壁培养细胞

1)培养皿/培养板准备细胞样本。

2)待细胞生长到合适丰度,去除细胞培养基,用PBS洗细胞一次。

3)加入适量体积37℃预热的含O52探针工作液。

【注】:

● 加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于6孔板的一个孔加入稀释好的O52探针不少于1mL，96孔板加入100-200μL。

● 也可以将细胞置于培养皿中的盖玻片上,加入合适培养基,使其爬片生长。

4)在37℃细胞培养箱内于生长状态下孵育20～40分钟(具体孵育时间需根据细胞类型而定,需预实验优化)。

5)移除染色液,用PBS(pH7.4)洗涤细胞3次。以充分去除未进入细胞内的O52探针。

【注】:

● 若染色不够充分,建议增加染料浓度或延长染色时间。

● 也可以用HBSS/无血清细胞培养基洗涤细胞。

6) 加入200μL HBSS缓冲液。

【注】:

● 也可以用PBS/细胞培养基。

7)荧光显微镜(含合适滤片)或荧光酶标仪下观察。最大激发/发射波长为488/516nm。

2.2 收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理

1)离心,吸除上清培养基。

2)用PBS洗细胞一次。

3)细胞收集后重悬浮于稀释好的37℃预热的O52探针工作液中，细胞浓度为1×10⁶-2×10⁷/mL。

4)于生长状态下37℃细胞培养箱内避光孵育20-30分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

5)离心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重悬细胞，洗涤3次。以充分去除未进入细胞内的O52探针。

6)用HBSS/PBS/无血清细胞培养基重悬细胞。

7)用荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪检测。

最大激发/发射波长为488nm/516nm。

【注】:

● 对于悬浮细胞,也可将细胞贴附于经细胞粘合剂处理过的盖玻片上,然后使用类似于贴壁细胞的方法进行染色。

● 如果需要盖玻片上固定化的细胞,那么可在铺片前可以先用多聚赖氨酸(poly-D-lysine)包被载玻片或盖玻片。

● 若染色不够充分,建议增加染料浓度或延长染色时间。

3、检测：

1)对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测，或者用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜，直接拍照分析（需要有相关的荧光强度分析软件）。

2)或收集细胞后标记探针然后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

3)对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接拍照分析也可以（需要有相关的荧光强度分析软件）。

4)使用488nm激发波长，520nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

探针O52的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测。

5) 荧光强度强，活性氮含量高。

【注】:

● 如果用显微镜拍照分析的话，需要细胞分布均匀。

● 要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野找。如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，作分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。

● 为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。

● 对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。

● 对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。

要根据课题需要选择合适的测量统计方法。

常见问题分析：

● 活性氮结果如何分析？

RNS是多种物质的统称，不像某一单一活性氮指标，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其RNS的变化，测定其RNS是增加或者降低了。

● 荧光照片如何分析？

需要有相关的荧光强度分析软件。RNS表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。

有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度，可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能，可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标进行分析。

要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野找。

如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，作分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。

为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。

对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。

要根据课题需要选择合适的测量统计方法。

● 荧光照片效果不好？

荧光拍照存在很多变量，每一个变量都会严重影响拍照效果。

荧光拍摄条件：拍摄环境、显微镜品牌和激发荧光决定了镜下观察的效果。同样的操作方法和切片，在不同品牌显微镜下显示出完全不同的荧光强度。

荧光衰减：荧光物质的衰减通常都是非常明显的。同样的一组切片，1小时内拍摄和8小时后拍摄，荧光效果完全不同。

最好用激光共聚焦显微镜，激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，通常同一张片子激光共聚焦的效果明显更优。

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