HR8306-500T LDH细胞毒性检测试剂盒

LDH细胞毒性检测试剂盒是利用LDH催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH通过电子载体将显色剂还原生成显色物质，在450nm处的OD值与LDH成正比，利用此原理可以测定死细胞和受损细胞的LDH漏出情况。...

LDH细胞毒性检测试剂盒

 

产品编号：HR8306

产品组成：

储存条件：

LDH反应液2-8℃避光保存，长期不用可-20℃保存，避免反复冻融。提取液2-8℃保存。有效期1年。

产品简介：

LDH乳酸脱氢酶检测试剂盒是利用LDH催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH通过电子载体将显色剂还原生成显色物质，在450nm处的OD值与LDH成正比，利用此原理可以测定死细胞和受损细胞的LDH漏出情况。

LDH（乳酸脱氢酶）是存在于细胞质的一种酶，LDH释放被看做细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞毒性检测。当细胞膜受到损伤时，LDH会释放到培养基中。由于释放出的LDH稳定，检测培养基中LDH的量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。

LDH细胞毒性检测试剂盒检测方法：

● 酶标仪 ● 分光光度计

样本类型：

● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器：

● 酶标仪/分光光度计 ● 离心机 ● 移液器 ● ● PBS缓冲液/HBSS（无酚红） ● 96孔板

注意事项：

● LDH反应液冻存后溶解时注意重新混匀。

● 冷冻会使样品中部分乳酸脱氢酶失活。建议样品准备好后尽量当天完成测定。

● 因为每种细胞的LDH量不同，建议通过预实验确定高LDH对照和低LDH对照的吸光度差异最大的细胞数。

● 培养基中动物血清中的LDH会增加背景吸收，建议设置一个培养基背景对照来校正。

● 动物血清中的LDH活性较高时，可以通过降低血清浓度来减小其中的LDH造成的背景吸收，一般将血清浓度降低到5%会显著减小背景。

● 细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大，都会造成细胞释放乳酸脱氢酶增加。

● 若需准确计算出漏出的LDH酶活性的绝对活性，请选用其它货号的试剂盒。

● 不同样本的LDH漏出情况不一样，需要做预实验确定加入LDH反应液后的孵育时间。

● 以下以96孔板培养为例，如果是使用的其它类型的培养板，以实际为准，等比例调整吸入对应规格的试剂即可。

● 因为每种细胞的LDH量不同，为了得到最好的显色效果，推荐做预实验确定最佳细胞量。没条件做细胞数量优化的话，可以选择较高细胞量实验。

LDH细胞毒性检测试剂盒使用方法：

关于对照孔设置：

● 一般按以下设置对照孔，仅供参考，也可以根据实验需要自己设置：（例如加入100μL细胞悬液，加入药物母液1-10μL。）

背景空白对照：保留两个或三个孔，使其不添加细胞和药物以用作背景空白对照。

向每个孔中添加110μL新鲜培养基。

待测样品空白对照：使两孔或三孔没有细胞，添加培养基和待测药物样品用作样品空白对照。

加入60μL新鲜培养基+ 50μL待测药物样品。

低LDH对照：使两孔或三孔含有细胞，无添加药物，用作低LDH对照。

加入60μL新鲜培养基+ 50μL细胞悬液。

高LDH对照：使两或三孔含有细胞，无添加药物，加入LDH提取液用作高LDH对照。

加入50μL新鲜培养基+ 50μL细胞悬液+10μL LDH提取液。

高LDH空白对照：使两孔或三孔不含细胞，无添加药物，加入LDH提取液用作高LDH空白对照。

加入100μL新鲜培养基+10μL LDH提取液。

表A：

	待测样品	背景空白对照	待测样品空白对照	低LDH对照	高LDH对照	高LDH空白对照
培养基	10μL	110μL	60μL	60μL	50μL	100μL
细胞	50μL	-	-	50μL	50μL	-
药物	50μL	-	50μL	-	-	-
LDH提取液	-	-	-	-	10μL	10μL

LDH细胞毒性检测试剂盒LDH测定：

1、吸取50μL用培养基稀释过的细胞悬液至96孔板中。

【注】：

● 用贴壁细胞时，接种细胞至96孔板过夜预培养，换成新的50μL培养基后，进行操作步骤2。

2、加入50μL含有药物的培养基（按表A）。

3、在37℃ CO₂培养箱内培养合适的时间。

4、在高LDH对照孔、高LDH空白对照孔中加入10μL LDH提取液后，在样品、样品空白、低LDH对照孔和背景空白孔中加入10μL 培养基（按表A），在37℃ CO₂培养箱内培养30-45分钟。

【注】：

● 加入LDH提取液的孔用移液器轻轻吹打混匀，中间每隔10分钟用移液器轻轻吹打混匀。

● LDH提取液比较粘稠，容易吸附在吸头壁，一定要注意有效加入培养基并充分混匀。

● 可以根据样品数量，按照每50μL培养基+10μL LDH提取液的比例预先多配制一些提取液的工作液，放大体积后提取液的终浓度会更加准确。

● 如果是其它培养体系，LDH提取液按孔中液体量10%加入即可。

5、96孔板离心2 min (250×g)，使悬浮细胞沉淀。

6、从每个孔中吸取100μL上清液至另一个新的96孔板中。

【注】：

● 为了避免吸出细胞，请小心吸取上清液。

7、在新的96孔板每个孔中加入10μL LDH反应液B后，在室温避光的条件下培养30钟-4小时。

【注】：

● 培养时间与预实验在每孔中加入10μL LDH反应液，采用包裹铝箔等方法避光，在室温反应一致。

● 一般45分钟-60分钟反应时间即可。

● 如果是其它培养体系，LDH反应液按孔中液体量10%加入即可。

8、用酶标仪测定450nm的吸光度。

LDH计算：

计算待测样品孔-样品空白孔、高LDH对照孔-高LDH对照空白孔、低LDH对照孔-背景空白孔的吸光度后，算出各种孔的复孔平均值。

细胞损伤率/毒性根据如下公式算出。

细胞损伤率/死亡率/毒性(%) = [(OD_A-OD_C)/(OD_B-OD_C)]×100%

LDH细胞毒性检测试剂盒其中：

OD_A：样品的吸光度(待测样品孔-样品空白孔)

OD_B：高LDH对照的吸光度(高LDH对照孔-高LDH对照空白孔)

OD_C：低LDH对照的吸光度(低LDH对照孔-背景空白孔)

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