GL1300 DNA退火缓冲液(5×)
产品简介
DNA退火缓冲液(5×)是高品质的核酸扩增(PCR)产品,由北京百奥莱博供应,本产品用于生化实验研究等领域,我公司的DNA退火缓冲液(5×)品质上佳,经过多年的开发生产,已然非常成熟,欢迎广大新老客户订购。...
产品详细介绍
特别提示:包括DNA退火缓冲液(5×)在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:DNA退火缓冲液(5×)
产品货号:GL1300
产品规格:1ml
用途:
用于DNA oligo退火的缓冲液
注意事项:
无菌溶液。主要由氯化钾、Tris、氯化镁等组成,经高压灭菌处理。
储存条件:-20℃,12个月
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货号 | 名称 | 规格 |
BTN130815 | taq酶抗体 | 500U |
BTN70902 | 5M甜菜碱溶液,PCR级 | 1.5mL |
YT400 | 核酸酶清除剂(核酸酶喷雾清除剂) | 250ml |
WE0150 | 一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(高含量ROX校正染料) | 100次 |
RFT160 | 5M甜菜碱溶液(PCR级) | 5×1ml |
JN0029 | BloTaq血液DNA聚合酶 | 400U |
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名称:可逆型Taq DNA聚合酶抑制剂
货号:BTN60901
规格:0.3mL
Taq DNA聚合酶是进行PCR的zuì常用工具酶,但是由于它在常温下还是具有部分活性,所以经常会出现非特异的扩增产物,尤其是当PCR反应体系中有大量非特异DNA存在的时候。目前zuì常见的解决方法是使用抗Taq DNA聚合酶的抗体和使用经过化学修饰的热启动Taq DNA聚合酶(如AmpliTaq Gold),但前者的缺点是加热后抗体会不可逆失活,后者的缺点是需要预热处理使酶激活。
产品特点:
1.可逆抑制Taq DNA聚合酶的活性,即常温抑制Taq酶活性,在45℃以上抑制功能丧失,当温度降低到45℃以下后,抑制活性又得以恢复。
2. 耐热,产品本身为非蛋白质试剂,远比Anti-Taq抗体稳定,便于保存和运输。
3. 使用简单,在加Taq酶前将本产品按PCR反应体积的1/10直接加入即可。
4.适用范围广,除Taq DNA聚合酶外,还可用于抑制其他DNA聚合酶的活性,如:Tth pol、Stoffel片段、Tfl pol、Tbr pol等。而一种酶的抗体一般对另一种酶的活性没有抑制作用。
5.与后续的RT-PCR兼容。
储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期一年。
使用方法:
在加入Taq或Tth DNA聚合酶之前,按PCR反应终体积1/10的比例将本产品加入到反应体系中混匀,然后再加入DNA聚合酶,启动PCR反应。
名称:即用型易错PCR试剂盒
货号:BTN101005
规格:100次
本产品就是专门为广大的研究工作者进行易错PCR而开发。易错PCR是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性,在一定条件下(如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体。
产品特点:
1. 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化,突变率稳定,突变没有趋向性。易错PCR的突变率为0.66%(±0.13%),详见使用手册疑难解答。
3. 比体内基因突变更快捷简单,但如果在PCR引物中设计位点,则可使产物克隆到表达载体,也可以用于体内蛋白活性的筛选。
4.可用于连续易错PCR,只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
5. 只适用于扩增1kb以下的产物,对于1kb以上的产物,建议分段扩增。
试剂盒组成:
成分 | 规格 |
Taq DNA聚合酶(5U/μL) | 100μl |
易错PCR Mix,10× | 300μl |
易错PCR专用dNTP,10× | 300μl |
MnCl2,5mM | 300μl |
说明书 | 1份 |
储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期为一年。
使用方法:
1.以30μL的标准PCR反应体系为例,如果反应体系不是30μL,各成分需要等按比例增加或减少。在一干净的PCR管中,加入下列成分:
易错PCR Mix,10× | 3μl |
易错PCR 专用dNTP,10× | 3μl |
MnCl2,5mM | 3μl |
自备DNA模板(10ng/μL) | 1μl |
PCR引物(自备,10μm each) | 10pmol each |
Taq DNA聚合酶(5U/μL) | 1-5U |
补水到 | 30μl |
2. 按已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR(循环数与突变率的关系见下表),然后取5μL电泳检查。如果没有优化的PCR条件,一般可以先尝试下面的PCR条件:
PCR前变性 | 94℃ 3分钟 | |
易错PCR | 94℃ 1分钟 | 循环30次(见注) |
45℃ 1分钟 | ||
72℃ 1分钟 |
注:易错PCR一般不需要热启动,也不需要在PCR结束后做延伸处理。
循环次数与突变几率的关系
易错PCR循环次数决定每个核苷酸位置的突变几率,进而决定每个PCR产物可能得突变位点数,所以所需循环数由客户根据需要改动。
PCR循环数 | 每个碱基突变几率 | PCR终产物中的突变位点数 | ||||
100bp | 200bp | 400bp | 800bp | 1600bp | ||
5 | 0.0033 | 0.00 | 0.66 | 1.3 | 2.6 | 5.3 |
10 | 0.0066 | 0.66 | 1.3 | 2.6 | 5.3 | 11 |
20 | 0.013 | 1.3 | 2.6 | 5.3 | 11 | 21 |
30 | 0.020 | 2.0 | 4.0 | 7.9 | 16 | 32 |
50 | 0.033 | 3.3 | 6.6 | 13 | 26 | 53 |
3.电泳检测是否得到预计长度的PCR产物。
疑难解答:
Q:易错PCR与定点突变PCR有什么区别?
A:定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组,也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化),包括碱基的添加、删除、点突变等。它需要预先知道靶基因的序列。易错PCR是一种随机突变,它不需要预先知道靶基因的序列(引物结合部分除外),但需要后续的筛选方法筛选自己所需要的突变。
Q:易错PCR的错误率是多少?
A:易错PCR的突变率为0.66%(±0.13%),对500bp的PCR产物,相当于有4%的PCR片段为野生型,12%的含一个突变,20%的含两个突变,22%的含三个突变,18%的含四个突变,12%的含五个突变,12%的含六个或更多突变。
Q:如果需要每个核苷酸有高于0.66%的突变率,如何办?
A:可以使用连续多次易错PCR来提高突变率。但zuì好先用胶纯化回收PCR片段,再用于下一轮PCR。此外不能用少于千分之一的次PCR产物作为第二轮易错PCR的模板,否则多样性将受到影响。第三轮易错PCRzuì好使用所有第二轮的PCR产物作为模板,但需要在10mL体系中完成(可以分成很多100μL体系进行)。
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