SYA774 人细小病毒B19核酸检测试剂盒

人细小病毒B19核酸检测试剂盒由专业试剂供应商北京百奥莱博提供，用于科学研究，我公司的人细小病毒B19核酸检测试剂盒品质上佳，经过多年的开发生产，已然非常成熟，欢迎广大新老客户订购。...

特别提示：包括人细小病毒B19核酸检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：人细小病毒B19核酸检测试剂盒
产品货号：SYA774
产品规格：48次/盒

人类细小病毒B19是英国科学家Cossart及其同事于1977年在筛查无症状乙肝患者血清时无意发现的，根据生化及分子生物学特点将其归为细小病毒科。由于其是在B组的第19号样品中发现的，故命名为B19病毒。zuì初人们认为B19是人群中普遍存在而不致病的一种病毒，但后来发现，B19感染是引起传染性红斑、慢性溶血性贫血患者发生再障危象、免疫抑制患者慢性贫血、孕期流产、死胎的病原体。
本试剂盒适用于检测人全血等标本中的人细小病毒(B19)DNA，适用于人细小病毒(B19)感染的辅助诊断，其检测结果仅供参考。
【检验原理】
本试剂盒用一对人细小病毒B19特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对人细小病毒B19核酸进行体外扩增检测，用于对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
名称 数量 规格
核酸提取液 2管 1.5ml
酶液 1管 50μl
B19反应液 1管 1.0ml
B19阳性质控品 1管 50μl
阴性质控品 1管 250μl
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃避光保存、运输、避免反复冻融，有效期12个月。
【适用仪器】
ABI系列、MJ系列、Roche系列、博日系列及其他荧光定量PCR检测仪。
【标本采集】
1. 适用标本类型：人全血；
2. 标本采集：
血液:无菌注射器抽取外周血1-2ml注入EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管；
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。
【使用方法】
1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理
取抗凝血下层(细胞层)50μl，加入200μl ddH2O使其胀破。
1.2 DNA提取
1) 取上述处理好的标本40μl，加入等体积核酸提取液，100℃恒温处理10分钟，13000 rpm离心5分钟，取上清液转移至新的1.5ml EP管，-20℃保存；
2) DNA的提取也可以采用北京百奥莱博科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(离心柱提取法)，请严格按照试剂盒说明书进行操作。
2. 试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1
管阴性对照+1管阳性对照)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 B19 反应液 酶液
用量 20μl 1μl
3. 加样(样本处理区)
将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μl，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4. PCR扩增(核酸扩增区)
4.1 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；
4.2 推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 94℃ 2min 否
2 40 cycle 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
反应体系为25ul；荧光通道检测选择：FAM通道。
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
1) 设置基线(baseline)：一般情况下，对ABI 7500、7700等仪器设为6-15cycle，对PE5700设为3-15cycle,对MJ Research Option2设为6-12cycle。特殊情况可对基线适当调整。
2) 设置阈值(threshold):以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的zuì高点。
5.2 结果判断
1) 阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；
2) 可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；
3) 阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40。
6. 对检验结果的解析
实验室环境污染，试剂污染，标本交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果。
7. 质控标准
1) 阴性质控品：扩增曲线无对数生长期或无Ct值显示；
2) 阳性质控品：扩增曲线有明显对数生长期，且Ct值≤32;
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。


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一、简介：
本试剂盒用一对呼吸道合胞病毒RSVA型特异性引物，一对呼吸道合胞病毒RSVB型特异性引物，分别结合一条特异性荧光探针，用一步法双重荧光RT-PCR 技术对呼吸道合胞病毒RSVA/RSVB 分型RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。本试剂盒中呼吸道合胞病毒RSVA型的探针报告基团为FAM，呼吸道合胞病毒RSVB 型的探针报告基团为VIC/HEX/JOE。

二、用途：
本试剂盒适用于各种咽拭子、鼻拭子样品等临床样品中呼吸道合胞病毒RSVA/RSVB分型的特异性检测。适用于呼吸道合胞病毒RSVA/RSVB分型感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供临床参考。

三、试剂盒组成：(48T)
组份 数量 规格
呼吸道合胞A/B反应液(RSVA/RSVB-qRT-PCR MIX) 1管 576μL/管
qRT 酶混合物(qRT Enzymes MIX) 1管 192μL/管
无核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
阴性对照(NTC) 1管 50μL/管
呼吸道合胞A/B 阳性对照(RSVA/RSVB-PTC) 1管 50μL/管

四、储存条件及有效期：
本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。

五、荧光PCR仪器适用范围：
ABI系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。

六、样品的采集与RNA提取
6.1 样品的采集
按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-80℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。
6.1.1 血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22-25℃)放置30-60min，血标本可自发完成凝集析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二钠)或柠檬酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后即可分离出血浆，转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.3 拭子、分泌物等样品：在装有拭子或分泌物的离心管中加入500μL PBS或生理盐水，剧烈振荡30s。棉拭子尽量挤出液体转移到无RNA酶污染的离心管中，6000rpm离心20s，取上清备用。
6.1.4 病灶组织样品：称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨(zuì好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理盐水研磨至无块状物，然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液于1.5mL灭菌离心管中。
6.2 RNA提取
可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的RNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取4μL 加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。

七、检测步骤：
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qRT-PCR 反应液(RSVA/RSVB-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm 离心10s。
设所需要的PCR 反应管管数为N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 12µL N×12µL
酶混合物 4µL N×4µL
总量 16µL N×16µL
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm 离心10s，向设定的N个PCR 反应管中分别加入16μL，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(RSVA/RSVB-PTC)4μL，10000rpm 瞬时离心10秒。
7.2 qRT-PCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
反转录(Reverse Transcription) 1循环 50℃ for 30 min
预变性 1循环 95℃ for 5 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 10 sec
55℃ for 45 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM和VIC(若仪器无VIC通道，可选择HEX或JOE通道)。其中FAM基团检测RSVA，VIC/HEX/JOE基团检测RSVB。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

八、结果分析：
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。
8.2 试验成立判定
(1) 阴性对照(NTC)：FAM和VIC/HEX/JOE通道均无扩增。
(2) 阳性对照(RSVA/RSVB-PTC)：FAM和VIC/HEX/JOE通道均有扩增。
以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效
8.3 结果判定
(1) FAM通道：Ct值≤35 RSVA核酸为阳性；Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明RSVA核酸阴性。
Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明RSVA核酸阳性；否则判为样本阴性。
(2) VIC/HEX/JOE通道：Ct值≤35 RSVB核酸为阳性；Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明RSVB核酸阴性。Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明RSVB核酸阳性；否则判为样本阴性。

九、注意事项：
(1) 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
(2) 所有使用的离心管zuì好高压灭菌，而且必须不含RNA 酶。
(3) PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR 扩增区等)，防止实验室污染。
(4) 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
(5) 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。


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