WE0197 血液RNA提取试剂盒

血液RNA提取试剂盒是高品质的RNA提取纯化产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于科研目的，我公司的血液RNA提取试剂盒品质上佳，经过多年的开发生产，已然非常成熟，欢迎广大新老客户订购。...

特别提示：包括血液RNA提取试剂盒(含DNase I)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：血液RNA提取试剂盒(含DNase I)
英文名称：RNAtiqu Blood RNA Extraction Kit(DNase I)
产品货号：WE0197
产品规格：50次

  本试剂盒适用于从新鲜全血(用柠檬酸盐、EDTA或肝素等抗凝剂处理过的血液样品)中提取总RNA，可处理多至1.5ml的全血，洗脱得到分子量大于200 bp的高纯度RNA，多个样品可以在1小时内同时完成。本产品无需CsCl纯化的超离心步骤和LiCl或乙醇沉淀，不含有苯酚或氯fǎng等有毒溶剂，经过纯化的RNA有效去除血红素、肝素等酶抑制剂和污染物，可直接用于各种分子生物学常规实验，如RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、体外翻译等实验。

试剂盒组成：

组份	50次
DNase I	1000 U
10×Reaction Buffer	1000μl
Buffer RBL(10×)	60ml
Buffer RL	35ml
Buffer RW1	40ml
Buffer RW2(浓缩液)	11ml
RNase-Free Water	10ml
过滤柱FL及收集管	50套
吸附柱RM及收集管	50套
RNase-Free离心管(1.5ml)	50个

保存条件：DNase I及10×Reaction Buffer -20℃保存，其它组分室温(15～30℃)。

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇。

实验前准备及重要注意事项：
1、预防RNase污染，应注意以下几方面：
1)使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2)配制溶液应使用无RNase的水。
3)操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2、样品应避免反复冻融，否则影响提取RNA提取得率和质量。样品在Buffer RL中，可于-70℃保存一个月。
3、Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇，1ml Buffer RL加10μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL室温可保存1个月。
4、次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
5、使用前请检查Buffer RL是否出现结晶或者沉淀，可置于于56℃水浴重新溶解。
6、本试剂盒不能用于加入抗凝剂的冷冻血液样本RNA的提取。
7、10×Buffer RBL需在使用前将溶液用无RNase的水进行10倍稀释，稀释后置于2～8℃保存。

操作步骤：
1、向新鲜的抗凝全血样本中，加入5倍血液样本体积的1×Buffer RBL(请于使用前用无RNase水将10×Buffer RBL稀释10倍)，轻轻涡旋或颠倒混匀。冰上孵育10-15分钟，孵育过程中混匀两次。
注意：孵育过程中浑浊的悬液会变成透明，证明红细胞被裂解，必要时可以把孵育时间延长至20分钟。
2、4℃ 2,100 rpm(~400×g)离心10分钟，小心吸弃上清。
3、向以上沉淀中加入2倍血液样本体积的1×Buffer RBL(请于使用前用无RNase水将10×Buffer RBL稀释10倍)，轻轻涡旋，充分重悬沉淀。
4、4℃ 2,100 rpm离心10分钟，小心并彻底吸弃上清。
注意：此步一定要完全去除上清否则影响裂解导致RNA产量下降。
5、向沉淀中加入Buffer RL(使用前检查是否已经加入β-巯基乙醇)，具体加量按照下表进行，涡旋混匀。
注意：如果血液不是健康人的全血，需要根据血液中白细胞的数量来确定所需Buffer RL的加入量。完全混匀后细胞应完全裂解，块状沉淀消失。

Buffer RL(μl)	健康人类全血(ml)	白细胞数量
350	小于0.5	多至2×106
600	0.5-1.5	2×106 至1×107

6、将以上所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中，12000rpm(~～13400×g)离心2分钟，收集滤液，弃掉过滤柱。
7、向滤液中加入1倍体积(600μl或350μl)的70%乙醇(无RNase水配制)，混匀。
注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，不会影响后续实验。
8、将上步所得溶液全部加入到吸附柱中(已装入收集管)，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10、配制DNase I 混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl)，混匀， 配制成终体积为80μl的反应液。
11、向吸附柱中直接加入80μl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分钟。
12、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
13、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
14、重复步骤13。
15、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR 等)。
16、将吸附柱置于一个新的RNase-Free的1.5ml离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：
1)RNase-Free Wate体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。
2)如果要提高RNA的产量，可用30-50μl新的RNase-Free Water再次洗脱，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
3)如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。

储存条件：室温(15～30℃)。

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名称：动物RNA提取试剂(TRIzol)
货号：BTN3070
规格：100mL
本试剂盒是类似于TRIzol、基于异硫氰酸胍/酚/氯fǎng提取原理的快速总RNA提取试剂，可用于从各种动物组织(包括白细胞)和部分植物材料中快速提取总RNA。

产品特点：
1. 操作简单快速，只要10分钟左右，可以全在室温下进行。
2. RNA 质量高，OD260/OD280一般在1.9左右。一般不含用RT-PCR可以检测到的基因组DNA污染。
3.适用于大部分实验材料，如培养细胞、各种动物材料和少数植物材料。植物RNA的提取zuì好使用植物RNA提取试剂盒。
4. 高于进口TRIzol和TRI Reagent等同类产品。

储存条件：常温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：
注意：下面的操作步骤是用1mL 本产品进行的微量提取的，细胞使用量一定要准确，不能超过下述用量，否则将超出本产品的裂解能力，RNA产量将急剧降低。如果样品量大，请按比例增加各成份的用量。RNA 工作环境zuì好用的固相RNase清除剂(BTN3080)彻底处理。
1. 对贴壁细胞(10 平方厘米)：吸尽培养液，加入1mL的本产品用枪充分吹打确保细胞全部裂解，然后将裂解液转移至干净的1.5mL塑料离心管中，进入第6 步。
2. 对悬浮细胞(五百万至一千万个)：离心收集细胞，吸尽液体，加入1mL本产品，用枪充分吹打确保细胞全部裂解，然后将裂解液转移到干净的1.5mL塑料离心管中，进入第6 步。
3. 对新鲜组织(50-100mg)：将新鲜组织剪切成小块，放入10mL或15mL塑料离心管中，加入1mL的本产品，用Polytron 剪切式匀浆器冰上匀浆30秒左右，将匀浆液转移至新的1.5mL塑料离心管中，进入第6步。注意：对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织(细胞中含大量正在复制的DNA)，使用量不要超过30-50mg，否则十分容易产生DNA污染。对10mg以下的组织，zuì好加入本公司的微量RNA 助沉剂。
4. 对RNAhold 保存的组织(50-100mg)：先用纸吸去RNAhold液体后再剪切成小块，其余操作同第3 步。RNAhold处理后的组织韧性很强，匀浆时间需要适当延长。
5. 对液氮中保存的组织(50-100mg)：在研钵中研磨成粉，加入1mL 本产品，用枪充分吹打确保细胞全部裂解，然后将裂解液转移到干净的1.5mL塑料离心管中，进入第6 步。
6.在装有裂解物/匀浆物的1.5mL塑料离心管中加入0.2mL自备氯fǎng，振荡器上充分振荡混均30秒。注意：一定要把官底的溶液震荡起来，否则只是液面的振动。
7. 13000-15000g室温离心3分钟。
8. 将上清液(约0.6mL)转移到另一干净的1.5mL塑料离心管中。下层有机相(蓝色)和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。为保险起见，可以留下50-100μl上清液不取。
9. 对脂类丰富的组织(如脂肪组织和脑组织)，需再重复氯fǎng抽提一到两次以让氯fǎng充分去除脂类分子。
10.在上清液中加入等体积的异丙醇，振荡器上振荡30秒混匀。
11. 13000-15000g室温离心5分钟，离心底的侧面将形成RNA沉淀。如果组织使用量低于10mg或需要提高RNA 回收率，可以将离心时间延长到20或30分钟。
12.小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。
13.在含RNA沉淀的离心管中加入1mL 75%乙醇，振荡混匀30秒。
14. 13000-15000g室温离心1分钟。
15.小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。
16. 重复第13-15的洗涤步骤一次(也可以省略)。
17. 短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留乙醇(约50μL)。注意不要吸弃RNA
沉淀。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响RNA的后续使用。
18.室温放1-2分钟后立即加入50-100μl RNase-free 水使RNA沉淀溶解。
千万不要用真空离心法使RNA沉淀过于干燥，否则RNA 将变得十分难溶。RNA样品可以立即使用或存放于-80℃待用。
注意：由于RNase-free 水没有主动灭活残留RNase的功能，而任何方法提取的RNA 都可能有残留的RNase，所以强烈建议客户使用本公司推出的具有主动灭活残留RNase 功能的、同时跟后续RT-PCR等反应兼容的液相RNase 清除剂(BTN3091)。

附一：RNA 完整性的电泳检测(仅供参考，本产品不含相关试剂)
如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子(BioTechniques，28：414，2000)。如果是简单检测，可以使用TAE缓冲液或超快核酸电泳液进行常规电泳，但文献报道必须使用RNAload这样的变性上样液(BioTechniques，9：558，1990)。普通DNA上样液不含变性剂，也没经过去RNase处理，所以zuì好不要使用，否则RNA容易降解。
动物RNA电泳后应该在UV下呈现三条清晰的rRNA 带，28S rRNA条带的荧光强度一般比18S rRNA 条带的荧光强度强1.5-2.3倍。如果这两条rRNA 带不清晰或比例小于此范围则表示RNA 有降解(因为大的RNA 被酶降解的可能更大)。
跟动物一样，植物果实和种子的RNA一般有三条电泳带，但植物叶片的RNA 有四条或更多rRNA带，多余的RNA 来源于叶绿体。
如果电泳发现RNA样品中有DNA污染(一般是使用过多样品造成)，可分别用非酶DNA 清除剂或RNase-free DNase 清除。

附二：RNA产量和纯度测定(仅供参考，本产品不含相关试剂)
用pH在7.5-8.2的TE缓冲液将5-10μL RNA稀释10-20倍后在OD260和OD260测光吸收，通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，进而计算出RNA的产量(浓度×体积)和产率(RNA产量/组织用量)。RNA的产率还随组织的营养状态和组织的种类不同而不同，一般来说，代谢旺盛的组织(如肝脏和肾脏)RNA的产率高，代谢不旺盛的组织(如肌肉和脂肪组织)RNA的产率低，下面是常见动物组织的RNA产率:
肌肉，胎盘和脑组织: 1-2μg RNA/mg 组织
肝，胰和肾组织: 5-10μg RNA/mg 组织
培养细胞: 5-15μg/10E6细胞
RNA的纯度通过OD260/OD280 来确定，一般在1.8-2.1之间即算合格。但即使低于此范围，一般也不会影响RT-PCR等反应。
蛋白质污染可以通过酚/氯fǎng抽提一次然后酒精沉淀去除，多糖污染可以用多糖清除剂去除。

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