BTN8091 超级杂交液(不含甲酰胺)

超级杂交液(不含甲酰胺)是高品质的探针标记及检测产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于科学研究，本品质量稳定，价位合理，需要超级杂交液(不含甲酰胺)等探针标记及检测产品的客户，请到我公司官网联系我们。...

特别提示：包括超级杂交液(不含甲酰胺)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：超级杂交液(不含甲酰胺)
英文名称：Super hybrid solution(formamide free)
产品货号：BTN8091
产品规格：100mL

核酸杂交一般是指用一种标记的核酸探针与印迹膜上的核酸进行杂交，由此检测印迹膜上是否存在与探针同源的核酸分子(靶分子)。核酸杂交是分子生物学的基本技术之一，应用非常广泛。由于核酸杂交效率受印迹膜种类、杂交温度、探针浓度、杂交液离子强度、杂交液pH及杂交液粘度等因素影响，用户自己摸索和优化相关条件非常繁琐，因此本公司开发了本产品，其操作流程如下：


产品特点：
1. 既可用于Southern杂交(靶分子为DNA)，也可用于和Northern杂交(靶分子为RNA)，还可以用于菌落杂交，基因芯片等杂交。
2. 既可以用于同位素探针的杂交，也可以用于非同位素探针的杂交。
3. 既可以使用DNA(包括DNA Oligo)探针，也可以使用RNA探针(包括RNA Oligo)
4.含多种能够促进杂交的聚合物，使杂交反应能在6～12小时完成，而常规杂交反应一般需要12～24小时。
5.含多种封堵剂，能阻印迹膜对探针分子的非特异性吸附，能有效降低背景信号，延长曝光时间以便检测到低拷贝的RNA(Northern)和单拷贝的基因(Southern)。
6. A型不含甲酰胺，B型含50%的甲酰胺。后者使杂交在较低温度就可以完成，适合Tm 较高的分子杂交(如RNA-RNA和RNA-DNA杂交)。
7.跟各种常用的印迹膜兼容，包括硝酸纤维素膜和尼龙膜。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。本产品属于高盐溶液，低温下产生沉淀，必须在65℃加热溶解并充分摇匀后才能使用。

使用方法：

一、根据探针和靶分子的不同，分别按下面不同情况计算杂交分子的Tm 值
1. 对DNA-DNA杂交，其Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+] + 0.41×GC%–500/L
说明：L是探针或靶分子的长度(用两者中zuì短的一个)
GC%是探针或靶分子中的GC 百分比(用两者中zuì短的一个)
Na+浓度是本产品中Na+的浓度，为0.75 M，16.6 ×log10[Na+]=(-2.07)
2. 对DNA-RNA杂交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高10-15℃。
3. 对RNA-RNA杂交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高20-25℃。
4. 对Oligo探针杂交，Tm=GC 数量×4℃+AT 数量×2℃。

二、确定zuì佳杂交温度(预杂交温度跟杂交温度应该一样)
1. 对于大于200bp的DNA-DNA杂交，zuì佳杂交温度一般比Tm低15-25℃，一般选择68℃。
2. 对RNA-RNA或DNA-RNA杂交，zuì佳杂交温度一般比Tm低15-25℃。如果这样计算出的杂交温度很高(如高于70℃)，则RNA容易降解，所以zuì好选用含甲酰胺的超级杂交液(B型本产品)，以便能在42℃完成杂交。
3. 对Oligo探针的杂交，zuì佳杂交温度一般比Tm低5℃。由于Oligo较短，更容易受各种因素影响(如错配率、修饰碱基比例等)，所以zuì佳温度需要适度摸索和优化。

三、确定洗膜温度
一般使用0.1×SSC做洗膜液，在此条件下的zuì佳洗膜温度比Tm低5-12℃，一般情况下可以在55℃进行洗膜。Oligo探针可以室温洗膜。

四、预杂交步骤
预杂交就是用不含探针的本产品跟印迹膜进行孵育，其目的是用所含的非特异性DNA分子(鲑精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物将印迹膜上会非特异地吸附探针分子的位点封闭，否则这些位点会吸附标记的探针，造成高背景。
1. 将结合了靶分子的硝酸纤维素印迹膜或尼龙印迹膜浸泡于自备的6×SSC溶液中，使其充分湿润。
2. 将湿润的印迹膜置于一塑料杂交袋中(塑料袋zuì好预先封口，再剪掉一角，留一个小口)，按每平方厘米印迹膜加0.2mL超级杂交液的比例沿小口加入超级杂交液，然后用塑料封口机将口封牢。
3. 将此塑料袋浸没入温度设定在zuì佳杂交温度的恒温水浴中或杂交炉中，保温1-2小时，延长到12-16小时亦可。注意保温过程中塑料袋应在不停的摇动状态中，使超级杂交液与印迹膜充分接触。

五、杂交步骤
1. 如果标记的探针是双链核酸，则需经变性处理。具体操作是将探针样品在沸水浴中加热5分钟，然后迅速置冰浴中。如果是单链DNA或RNA探针，则不需变性，直接使用。
2. 将单链探针或变性后的双链探针加入到完成了预杂交的杂交袋中(先用剪刀剪一小口，加入探针后用热封机封口)。探针的加入量视探针标记效率而定，一般要求终浓度不能低于1-2 ng/mL。如果检测基因组中的单拷贝基因，探针的加入量应加大，而对于检测克隆的基因片段，则探针的量可减少。如果是放射性探针，应将此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免杂交袋发生遗漏、污染工作环境。
3.在选定的杂交温度下继续保温，时间一般为6-12小时。

六、洗膜步骤。注意在下面的所有操作过程中，一定不要使印迹膜干燥。
此步是将与印迹膜非特异结合的探针分子洗去而只留下特异结合的探针分子。由于非特异性杂交的杂交分子解链温度较低，热稳定性较差，在一定的温度和较低的离子强度下，即可洗掉。
1.杂交完毕，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探针的杂交液。此含探针的杂交液可以多次使用再倒弃。
2. 剪开杂交袋，用镊子取出印迹膜，浸没于大量的2×SSC(含0.5%SDS)溶液中，室温下振荡漂洗15分钟。
3. 重复上步操作一次。
4. 将印迹膜转移至0.1×SSC(含0.1% SDS)溶液中，在计算好的洗膜温度下振荡漂洗30分钟至1小时。
5. 重复上步操作一次。如果是同位素标记探针，则需要重复至用盖革计数器在无核酸区域检测不出放射信号为止。
6. 将印迹膜转移到滤纸上，吸去表面液体后印迹膜即可用于后续检测。

疑难解答：
问题一：高背景(有或没有杂交信号)
解决方案：将放射性探针的比活降低到2×10E6 cpm/mL以下；将非放射性探针的终浓度降低到30 ng/mL以下；将探针长度控制在200–800 核苷酸；减少杂交时间；适当提高杂交温度。
问题二：没有杂交信号或杂交信号非常弱
解决方案：杂交过程中应应该连续振荡，不应该有气泡，避免印迹膜变干。将放射性探针活性提高到>5×10E8 cpm/ng，提高非放射性标记探针的终浓度；适当降低杂交温度。

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名称：PCR法DNA探针dì高辛标记试剂盒
货号：BTN90604C
规格：5次
PCR标记的原理是用带标记的dNTP进行PCR，zuì后得到的PCR产物将带有标记，可以直接用于杂交试验。其原理示意图如下：


产品特点：
1.一站式，本试剂盒提供经过优化的试剂，不需要用户自己摸索。
2. 足够10次50μl体系的常规PCR(用于制备标记反应的模板和设置对照反应)和5次50μl体系的标记反应。
3.一次标记可以得到μg级的双链DNA探针或约700ng的单链DNA探针，足够多次杂交实验用。
4. 既可用于制备双链探针，也可以用于单链探针。
5. 90604A需自备含标记核苷酸的dNTP，90604B和90604C分别含生物素和dì高辛标记的底物。自备的标记包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本产品得到的探针参入率一般为4-5%(每100个核苷酸中有4-5个将带有非同位素标记)，有效降低了空间阻碍，检测效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等分析。

试剂盒组成：

成分	规格
2×标记专用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(仅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(仅C有)
超纯水	1ml
说明书	1份

注：标记专用PCR Mix不含dNTP。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：准备工作
1. 按常规的方法设计PCR引物，使探针长度在400-800bp之间。过短则标记参入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
2. 根据PCR引物优化PCR条件。
3. 由于标记的dNTP比较珍贵，所以本试剂盒不推荐以基因组DNA或其他复杂DNA为模板直接进行PCR标记，而是建议采取下述的两步法标记来提高成功率，即先制备非标记PCR产物，再以之为模板制备标记的PCR产物。
二：非标记PCR产物的制备
4. 设置50μL PCR的反应体系：

成份	用量
2×标记专用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自备的探针引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自备的探针引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自备的模板DNA	1μg基因组DNA或1ng质粒DNA
超纯水	补到50μL

5. 按已经优化的PCR参数进行PCR。
6.电泳检测和胶回收所需的PCR产物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR产物(具体取决于PCR产物的长度)。注意：zuì好采取胶回收而不是PCR回收以避免残留引物干扰后续的标记PCR。
三：标记PCR反应(zuì好做一个不加标记的对照用于定量)
说明：在设置下面反应时，如果加一种引物，就得到单链标记的PCR产物；如果加两种引物，则得到双链标记的PCR产物。由于双链PCR探针在杂交前虽然要变性成单链后使用，但杂交时变性的双链彼此还会复性，这种复性会与探针-靶DNA杂交反应相竞争，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记的DNA探针。

成份	样品	对照
2×标记专用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自备的含其他标记dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
双链标记：探针引物一和引物二 单链标记：探针引物一或引物二	每种50 pmol 一种50 pmol	每种50 pmol 一种50 pmol
上步胶纯化所得PCR产物 (单链标记可用100ng)	10 ng	10 ng
超纯水	补到50μL	补到50μL

 注意：本试剂盒提供的dNTP混合物中，标记底物与非标记底物的比例已经进过优化，如果自备标记dUTP，其与dTTP的zuì佳比例需要优化，标记不同，比例不同。对DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；对BrdUTP，zuì佳比例为1：1。
7. 按第5步的PCR参数进行标记PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到35-55个循环。由于模板为纯化后的PCR产物，探针对扩增长度完整性要求不高(长度不均的探针由于能形成网络结构，效果反而更好)，所以可以增加循环数；二是延伸时间增加15秒，因为标记dUTP参入到DNA的速度比常规的dTTP慢；三是降低复性温度5-7℃，因为标记核苷酸参入到DNA后，新模板的Tm值将降低。
8. 标记探针的定量：取标记反应和对照反应的产物1-5μl，在琼脂糖凝胶上跟浓度已知的DNA marker一起电泳，并判断探针的浓度。由于标记反应的PCR产物中额外带有非同位素的配体(生物素，dì高辛等)、因此其泳动速度将慢于非标记PCR产物(但同位素标记不能用此法)。
 注意：如果扩增的是单链DNA探针，其结合EB的能力远低于双链DNA(EB是嵌合到双链碱基对之间的，而单链DNA没有碱基对，只有一些局部区域折叠形成的有限双链区，因此能结合的EB很少)，因此EB染色的强弱不能准确反应DNA的浓度，可以采用银染定量(跟marker比较)。一般100ng模板按上述条件经过单链PCR扩增可得到700ng左右探针。
9. 剩余的PCR标记产物可以不经过纯化，直接加入(对单链PCR探针)杂或加热变性并急冷后加入(对双链PCR探针)到杂交液中使用。如果暂时不用请放-20℃长期保存。如果需要纯化，请使用乙酸铵/乙醇沉淀法。

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