MT0007 血清/血浆TaqMan micr

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特别提示：包括血清/血浆TaqMan microRNA反转录试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：血清/血浆TaqMan microRNA反转录试剂盒
英文名称：TaqMan microRNA cDNA Synthesis Kit For Serum/Plasma Sample
产品货号：MT0007
产品规格：25T|100T

血清/血浆TaqMan miRNA反转录试剂盒采用加A法进行反转录，加A法的反转录效率远高于茎环法，因此，采用该方法可大的提高检测灵敏度（原理见图 1）。该试剂盒操作简单，仅需要两步即可轻松完成miRNA的cDNA 合成，合成的cDNA 可用于所有 miRNA的后续定量检测。反转录完毕后采用特异性的上游引物和接头引物进行 PCR 扩增，FAM 标记 TaqMan 探针作为荧光报告基团进行定量检测。

Biorab的血清血浆TaqMan miRNA反转录试剂盒专用于血清血浆miRNAs分子的反转录试验（不可用于组织和细胞），转录获得的cDNA产物用于TaqMan定量PCR方法检测miRNAs分子（仅适用Biorab TaqMan miRNA定量PCR试剂盒，货号：MTTxxxxx）。


图 1：血清/血浆TaqMan miRNA 反转录试剂盒原理图

产品组成：

组分	MT0007(25T）	MT0007(100T)
5×TaqMan miRNA RT Solution A	65μl	250μl
10×TaqMan miRNA RT Solution B	65μl	250μl
10×PS TaqMan miRNA RT Primer	65μl	250μl
RNase-Free H2O	1ml	1ml×2

储存：请置于-20℃，可保存2年；避免反复冻融

操作方法：
1．按以下组分在0.2ml EP管中配制应液
  血清血浆 miRNA——————————————10μl
  5×TaqMan miRNA RT Solution A——————2.5μl
2．在PCR 仪上按以下条件进行加 A 反应:
  37℃—————————30分钟
  85℃—————————5分钟
3．反应完毕后，在上述12.5μl 反应体系中加入如下试剂，并混合均匀。
  10×PS TaqMan miRNA RT Primer——————2.5μl
  10×TaqMan miRNA RT Solution B——————2.5μl
  H2O 7.5μl
4．在PCR 仪上按以下条件进行反转录反应:
  30℃——————5分钟
  55℃——————60min
  95℃——————5分钟
获得的cDNA 产物可用于多个目标 miRNA的检测。通常取2μl即可用于 TaqMan miRNA 定量 PCR 试剂盒检测(货号：MTTxxxxx)，该试剂盒有一万余种，详细列表可查询。
5．利用TaqMan qPCR Kit 对上述miRNA cDNA 产物进行 RealTime PCR 检测。
内参基因可选择使用：TaqMan hsa-miR16 miRNA 定量PCR 试剂盒(货号：MTT01511)； TaqMan cel-miR-39 miRNA 定量 PCR 试剂盒(货号：MTT01513)。

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货号	名称	规格
WE0233	DNA文库定量试剂盒(Ion Torrent平台)	1ml|5ml
ZN0024	ADAM15 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0129	BID mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0171	CACNAIF mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0196	Caspase-6 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0223	CCL11 mRNA原位杂交试剂盒	100T

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名称：ADFP/ADRP mRNA原位杂交试剂盒
货号：ZN0027
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.ADFP/ADRP mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高xīn 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高xīn：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
ADFP/ADRP的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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