JN0103 Easy Cloning T载体

我公司致力于为客户提供高纯度、低成本的活性重组蛋白，包括Easy Cloning T载体在内的各类受体、细胞因子、生长因子、转录因子、激素、酶、毒性蛋白、病毒抗原等。...

特别提示：包括Easy Cloning T载体(pEC-T)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Easy Cloning T载体(pEC-T)
英文名称：Easy Cloning T-vector(pEC-T)
产品货号：JN0103
产品规格：20次

  本品是一种PCR产物TA克隆的专用T载体。 它由pBluescript II KS载体改造而成：保留了pBluescript II KS载 体全部的酶切位点；PCR产物插入位点处于多克隆酶切位点的中间，其两侧都有众多的酶切位点可供选择。由于本载体以pBluescript II KS 载体为基础构建而成，所以它具有同pBluescript II KS载体相同的功能：PCR产物插入后可以利用a-互补性进行蓝白斑筛选，挑选阳性克隆。可以用M13通用引物和T7，T3启动子引物对PCR产物进行测序。含有T7及T3 RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录。

产品组成：

组份	规格
pEC-T vector（25 ng/μl）	100μl
T4 DNA Ligase	30ul
2×Quick Ligation Buffer	500ul
10×Ligation Buffer	500ul
Control Insert（50 ng/μl）	10ul
附赠
2×Taq MasterMix (快速上样型)	1ml×2
2×Fast Taq MasterMix (快速上样型)	1ml
DNA Ladder 2000 Plus	100ul

产品特点：
1、15分钟快速连接：
· 随酶提供独特配方的2×快速及10×普通T4 DNA Ligation Buffer。
· 使用2×快速Buffer在室温(25℃)下，仅需15分钟即可完成连接反应。
2、自带超快PCR鉴定2×Fast Taq MasterMix及DNA Marker：
2×Fast Taq MasterMix (Quick Load型)已含有PCR反应所需的快速型PCR聚合 酶、dNTP混合物、MgCl2、上样染料以及反应缓冲液预先，使用时只需再加入 模板和引物并稀释到1倍浓度即可进行PCR反应。其扩增速度为普通Taq酶的数 倍，因此可大幅度缩短PCR鉴定过程所需要的时间， 试剂盒自带预混1×Loading Buffer的DNA Ladder 2000 Plus，能满足大部分PCR产物电泳的需要。




质量控制：
· Control Insert克隆后的白色菌落中，有90%以上 含有Insert DNA片段。
· Control Insert经克隆后，经测序确认“T”突出的存在。

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名称：即用型蓝白T载体A型(T7-SP6，有MCS)
货号：BTN60603
规格：20次
本产品是用Xcm I酶切环状的可保种型蓝白T载体(BTN60803)去掉一段1.3Kb的插入片段后得到的线性DNA片段(载体部分)，其两个末端的5′都有一个突出的T，可以用于快速克隆具有加尾活性的耐热酶(如Taq DNA聚合酶)扩增得到的PCR片段。

产品特点：
1. 由于是通过Xcm I酶切制备，所以载体两端的带T率为，远高于用Taq DNA聚合酶和TdT末端转移酶在平末端载体加尾得到的T载体。
2. 克隆的阳性率一般在90%以上，缩短了筛选过程。
3. 插入位点两侧有对称的常见酶切位点(如EcoR I)，便于对克隆的PCR片段进行近一步的分析。
4. 克隆位点两侧分别有T7和T3 RNA聚合酶启动子，便于用克隆的PCR片段制备RNA探针。
5.可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。
6. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α-肽编码区内，可以进行蓝白斑筛选。
7.含有丝状噬菌体f1 复制起始子，可以制备单链DNA。

产品组成：

成分	规格
即用型蓝白T载体(40ng/uL)	20μl
阳性对照(40ng/uL)	5μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期两年。

使用方法：

一. PCR产物的纯化和定量
1. 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离。zuì好不要使用TBE缓冲液，因为它会影响DNA的胶回收效率。
2.在长波(360nm)紫外灯下快速切胶，尽可能切掉多余的凝胶。为避免嘧啶二聚体的形成，可以使用百奥莱博的DNA防护剂UV Scavenger(BTN60601)。
3. 用百奥莱博的柱式DNArc(BTN60202)纯化回收PCR片段。溶解PCR片段的超纯水体积越小越便于后续操作。
4. 将回收的片段与浓度已知的DNA Marker在含EB(BTN3180)或绿如蓝染料(BTN70303)的琼脂糖凝胶中电泳，通过比较DNA条带的荧光强度而估测PCR纯化产物的浓度。注意：一般不推荐使用测OD260的方法，因为回收的DNA很珍贵，该方法需要比较多的DNA。
5. 如果所得的DNA片段浓度较低，可以使用本公司核酸浓缩剂(BTN110801)将其浓缩到需要的浓度。
6. 如果PCR片段为平末端，则需要用加A试剂盒处理，否则不能用于与T载体的连接反应。

二. 连接反应
1. 短暂离心装有T载体的离心管。
2.在两个离心管中加入下列成分：

成分	样品管	负对照	正对照
自备T4 Ligase Buffer，10×	1μl	1μl	1μl
蓝白T载体(40 ng/uL)	1μl	1μl	1μl
自备PCR纯化产物	见下注	不加	不加
阳性对照(40ng/uL)	不加	不加	1μl
自备T4 Ligase(5-10U/μL)	1μl	1μl	1μl
补超纯水到	10μl	10μl	10μl

注：PCR纯化产物与蓝白T载体的摩尔比zuì好为3-10，可以按下面的公式计算出连接反应中需要的PCR纯化产物的ng数:

假如插入片段和载体的连接比例设定为3，连接反应中加入蓝白T载体(长度为3Kb)的量为40ng，则需要长度为0.5Kb的PCR纯化产物的量是:

3. 用移液器吹打连接反应使之混匀后，16℃孵育12小时(或按T4 Ligase供货商提供的说明书进行连接)。

三. 细菌转化
1. 将100μL感受态细胞于冰上解冻。注意：zuì好使用转化效率在1×108cfu/μg DNA以上的感受态细胞进行转化，因为采用单碱基突出端进行连接不是很有效。
2. 取5μL连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。
3. 将管放入预加温到42℃的水浴中，热休克90秒。快速将管转移到冰浴中。

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