CZ018 Mag NHS磁珠

Mag NHS磁珠由北京百奥莱博供货并提供相关技术服务支持，本品用于科研目的，本品质量稳定，价位合理，需要Mag NHS磁珠等磁珠微球产品的客户，请到我公司官网联系我们。...

特别提示：包括Mag NHS磁珠在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Mag NHS磁珠
英文名称：Mag NHS
产品货号：CZ018
产品规格：1ml/5ml/50ml

产品简介：
Mag NHS表面为NHS基团修饰，能够与带有伯胺基团的蛋白和其他分子形成稳定的肽键，用于亲和纯化抗体、抗原和其他生物分子。与传统的羧基、氨基磁珠相比，表面含NHS基团的磁珠无需先采用EDC/NHS或戊二醛进行活化，只需简单地将含伯氨基的生物配体溶解在试剂盒自带的Coupling Buffer中，室温下将蛋白与NHS磁珠混合1～2 h便可将生物配体共价偶联到磁珠上，具有操作简单、偶联条件温和、生物配体偶联快速等优点。磁珠偶联过程必需在不含任何氨基的缓冲溶剂中进行。人工操作时，使用磁性分离架实现磁珠与溶剂分离。也可采用自动化设备操作，自动化操作适合用于多样品的筛选。
蛋白偶联操作优化点：
1. 其中磁珠洗涤要严格按照说明书采用冷却的Washing Buffer A快速洗涤，以防磁珠在洗涤过程中NHS基团水解；
2. 蛋白偶联过程中，先要通过实验确定合适的 Coupling Buffer(主要包括 Coupling Buffer A、 Coupling Buffer B、50 mM硼酸溶液，pH 8.5、100 mM 磷酸缓冲液，100 mM NaCl，pH 7.4这四种)；
3. 确定合适的Coupling Buffer后，再以此Coupling Buffer为基础，确定合适的偶联蛋白浓度，因为蛋白浓度越高，偶联到磁珠上的蛋白的量会越大(这是由于NHS基团跟蛋白偶联和NHS基团本身水解是一对竞争反应)。当然此处要综合考虑使用性能和成本，有些客户偶联少量的蛋白便可满足使用需求，这时采用低浓度的蛋白便可，这样可以降低成本。
4. 封闭这一步可以采用试剂盒中自带的3 M乙醇胺，也可使用Tris缓冲液(100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0)，封闭时间不得低于2 h，如果化学封闭后背景仍然很高，还可以额外加一步BSA封闭。
蛋白偶联操作步骤：
以下操作过程以取磁珠样品500μL，采用1.5 mL EP管为例介绍。用户可根据自身需求按比例调整：
1. 蛋白溶液配制：
取适量待偶联蛋白用Coupling Buffer溶解，配成浓度为0.1-3.0 mg/mL的蛋白溶液。已经保存于buffer 中的蛋白，需要通过透析或者脱盐的方法彻底除去原有buffer里含伯胺基的物质，然后再用Coupling Buffer配成浓度为0.1-3.0 mg/mL的蛋白溶液，将配制好的蛋白溶液于4℃保存备用。
注：(1)为了达到更好的性能，当蛋白浓度≥2 mg/mL时，此时偶联效率会更高，不过需根据成本和使用要求综合考虑；
(2)蛋白溶液中不能含有带伯氨基的成分，比如Tris，甘氨酸，明胶，BSA等；
2. 取500 μL磁珠于1.5 mLEP管中。
注：磁珠取样前要反复颠倒、使用涡旋振荡器或者垂直混合仪使其混合均匀，以保证实验的同一性。
3. 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
4. 加1 mL 2～8℃的预冷的Washing Buffer A于1.5 mL EP管中，涡旋15 s，使磁珠混合均匀。
5. 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
6. 加500 μL蛋白溶液于EP管中，涡旋30 s，使其混合均匀。
7. 将EP管涡旋15 s，置于垂直混合仪上，室温混合1～2 h。如果垂直混合不均匀，则反应前30 min，每隔5 min取下EP管涡旋15 s。此后，每隔15 min，取下EP管涡旋15 s。
8. 采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。
9. 加1 mL Blocking Buffer于EP管中，涡旋30 s，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。
注：Blocking Buffer除了试剂盒中提供的3 M乙醇胺外，也可以使用100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0等其它封端试剂。
10. 重复“步骤9”操作四次。
11. 加1 mL Blocking Buffer于EP管中，涡旋30 s，将EP管置于垂直混合仪中室温反应2 h。
12.将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。
13.加1 mL 超纯水于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。
14.加1 mL Storage Buffer(比如含0.05%叠氮化钠的PBS缓冲液，或者客户根据自己实际需求选择合适的保存溶液 )于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次。
15.加入500 μL Storage Buffer于EP管中，充分混合，4℃保存备用。
注：zuì终偶联蛋白后的磁珠浓度为10 mg/mL。
注意事项：
1. 磁珠对水敏感。为了保证产品质量，在取样之后需立即盖上瓶盖，并用封口膜密封，于4℃保存。
2. 禁止将磁珠干燥或冷冻。干燥和冷冻操作可能导致磁珠的聚集从而丧失结合活性。
3. 可通过间接法(e.g., Thermo Scientific™Pierce™660nm Protein Assay, Product No. 22660 and 22662)测定反应前后蛋白含量，或通过直接法(e.g.,use the Thermo Scientific™Pierce™Micro BCA Protein Assay ，Product No. 23235)检测偶联到磁珠表面的蛋白含量，使用280 nm附近的波长来测定蛋白含量是不可取的，因为NHS基团在280 nm波长附近有很强的吸收，会严重干扰检测结果。
4. 蛋白稳定剂(如BSA，gelatin)会抑制抗体与磁珠的结合，因此在磁珠偶联抗体过程中，需要确保抗体保存体系中不存在含伯氨基的蛋白稳定剂。
5. 缓冲液中含有带伯胺的物质会抑制蛋白质偶联到磁珠表面，去除伯胺物质可采用透析和脱盐的方法。
6. NHS基团易水解，故在用Washing buffer A洗涤时，一定要参照说明书进行。
7. 蛋白溶液要预先配制好，Washing buffer A洗涤完毕后，要立即加入蛋白溶液进行偶联反应。
8. 蛋白质和磁珠的偶联效率因蛋白质种类和性质差异而不同。一般而言，蛋白质浓度为0.1-3.0 mg/mL时利于蛋白质偶联；然而，对于不同的蛋白其浓度需要优化。

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名称：镍离子螯和His-tag蛋白纯化磁珠
货号：CZ005
规格：5ml/2×50ml/4×250ml
产品简介：
组氨酸标签蛋白纯化磁珠具有超顺磁性，专为、快速纯化组氨酸标签蛋白而设计的一种功能化材料。可通过磁性分离方式直接从生物样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白，大地简化纯化工艺和提高纯化效率，适合科研和工业领域便捷地进行组氨酸标签蛋白纯化。
与传统层析方式使用的金属螯合琼脂糖预装柱相比，采用磁珠纯化组氨酸标签蛋白，无需对样品进行多次长时间的高速离心和滤膜过滤、无需控制流速、更无需高昂的层析设备。样品与磁珠的特异性结合、洗涤以及目标蛋白的洗脱变得简单、快速、易操作。对于熟练的操作者而言，在1 h内就能获得高纯度的目标蛋白，且能轻松实现高通量和大规模样品的平行处理，为研究者节省了时间和成本。
本产品系列包括镍离子(Nickel)、钴离子(Cobalt)两种金属离子螯合磁珠，它们在目标蛋白结合量和非特异性吸附等性能上有所区别，用户可根据目标蛋白与不同种类金属的结合性能，以及对目标蛋白的产量和纯度的要求，选择不同种类的金属离子螯合磁珠。具体产品信息及规格参考《产品特性》。
保质期 在2～8℃可稳定保存，保质期2年
注1：磁珠蛋白结合量与目标蛋白特性有关，此处仅做参考值
注2：1 mL 磁珠悬液中包含100 μL磁珠
注3：磁珠溶剂耐受性请参考附录信息
适用范围：
适用于纯化细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达的可溶性组氨酸标签蛋白，也可用于变性蛋白的纯化(包涵体需变性后再进行纯化)。
操作流程：
1. 缓冲液的准备
目标蛋白与组氨酸标签蛋白纯化磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，而各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此，在较大规模蛋白纯化之前，用户应该自行设计实验，筛选出适合纯化目标蛋白的缓冲液体系，主要包括Binding Buffer、Washing Buffer、Elution Buffer。
增加咪唑浓度进行洗脱是组氨酸标签纯化磁珠zuì常用的洗脱方法，次使用时，在不确定zuì佳的洗脱咪唑浓度情况下，推荐在缓冲液中分别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、300 mM、400 mM、500 mM咪唑，浓度从低到高分别洗脱，磁吸后收集蛋白上清液，之后通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。
以下提供的缓冲液体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化，供用户参考。
Binding Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，5～50 mM Imidazole，pH7.4
Washing Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，50～100 mM Imidazole，pH7.4
Elution Buffer：20 mM Phosphate Buffer，500 mM NaCl，500 mM Imidazole，pH7.4
2. 样品处理
本说明书提供以下三种样品的处理方法：
(1)大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量的Binding Buffer稀释，加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF)，重悬细胞，冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，冰浴30 min，以降解核酸。另外，用户也可以根据实际需要对蛋白样品进行离心操作。
(2)胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量Binding Buffer稀释，即为粗蛋白样品。
(3)动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，先用适量PBS洗涤1次，弃上清；接着用适量含1%(v/v)Triton X-100或1%(v/v)NP-40的Binding Buffer重悬，加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF)，冰浴10 min，即为粗蛋白样品。
3. 磁珠预处理
一般情况下，磁珠的使用量是由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得。例如：采用大肠杆菌表达某目标蛋白，500 mL发酵液收获2 g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为10～20 mg，用户需要取5 mL磁珠悬液用于目标蛋白的纯化。以下即以此为例进行详细说明：
(1)将磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取5 mL磁珠悬液于15 mL离心管中，进行磁性分离*，弃上清液，从磁性分离器上取下离心管。
(2)加入5 mL Binding Buffer到上述装有磁珠的离心管中，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮；进行磁性分离，移去上清液。重复洗涤2次。
(注*：在磁性分离过程中，为了减少磁珠在使用过程中的损耗，待溶液变澄清后，盖紧离心管盖子，保持离心管仍在磁性分离器上，手持磁性分离器与离心管上下翻转数次，使澄清的溶液涮洗离心管盖上残留的磁珠，静置片刻，使溶液重新变澄清；以下同。)
4. 目标蛋白与磁珠结合
(1)用10 mL Binding Buffer悬浮2 g湿重的菌体，进行破碎和裂解之后，即为目标粗蛋白样品，加入到装有预处理磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡混匀器振荡15 s。
(2)将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合20～30 min(如果需要，可以在2～8℃ 的低温环境下，旋转混1 h，防止目标蛋白降解)。
(3)将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液至新的离心管中以备后续检测，从磁性分离器上取下离心管进行后续洗涤步骤。
5. 磁珠洗涤
(1)加入10 mL Washing Buffer到装有磁珠的离心管中，轻轻翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测。重复此步骤1次。
(2)加入10 mL Washing Buffer到装有磁珠的离心管，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移到新的离心管(避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白)，磁性分离，移出上清液到清洗液收集管。
6. 目标蛋白洗脱
(1)用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度，加入2～10 mL Elution Buffer，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品。
(2)如果需要，可以重复上述步骤1次，收集样品到新的离心管中，以检测目标蛋白是否洗脱完全。
7. 磁珠后处理
(1)在装有磁珠的离心管中加入5 mL Elution Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，去除上清液。
(2)重复上述步骤2次。
(3)在离心管中加入5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，去除上清液。
(4)重复上述步骤2次。
(5)加入Storage Buffer到磁珠中使总体积为5 mL，保存于2～30℃(长期保存，置于2～8℃)，可用于下一次同种蛋白的纯化。
8. 磁珠再生
磁珠连续使用三次以上，其结合目标蛋白的能力可能会明显降低，建议进行磁珠再生处理。
Stripping Buffer：20 mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，100 mM EDTA，pH 7.4
Beads Washing Buffer(可选)：0.5 M NaOH，2 M NaCl
Recharge Buffer：100 mM NiSO4/CoCl2(该化学试剂有一定的毒性，可能造成过敏反应，使用时务必注意)
Storage Buffer：20%(v/v)乙醇
以5 mL 10%(v/v)磁珠悬液为例，详细说明磁珠再生操作：
(1)将磁珠悬液进行磁性分离，去除上清液，从磁性分离器上取下离心管，在离心管中加入5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。
(2)加入5 mL Stripping Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合5 min，磁性分离，去除上清液。重复此步骤1次。
(3)加入5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液，重复此步骤2次。
(4)碱处理：加入5 mL Beads Washing Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合5 min，磁性分离，去除上清液。加入5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。重复 ddH2O洗涤步骤3～5次，至洗涤液呈中性为止。
(5)加入5 mL Recharge Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合20 min，磁性分离，去除上清液。
(6)加入5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。重复此步骤4次以上，保证镍离子去除完全。
(7)加入Storage Buffer到磁珠中使总体积为5 mL，保存于2～30℃(长期保存，置于2～8℃)。
蛋白纯化流程的优化：
以上操作流程适用于大部分组氨酸标签蛋白的纯化，根据目标蛋白与金属离子螯合磁珠的结合性能不同，用户可以从以下几个方面对纯化流程进行优化，以提高目标蛋白的回收率和纯度。
提高目标蛋白回收率的参考方法：
(1)降低样品溶液和Binding Buffer中的Imidazole浓度；
(2)样品溶液和其它缓冲液中添加表面活性剂等物质；
(3)添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；
(4)增加磁珠用量；
(5)延长蛋白与磁珠孵育的时间；
(6)延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数。
提高目标蛋白纯度的参考方法：
(1)提高样品溶液和Binding Buffer中Imidazole、NaCl的浓度；
(2)样品和缓冲液中添加表面活性剂等物质；
(3)添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；
(4)延长洗涤的时间，增加洗涤次数；
(5)采用梯度Imidazole浓度洗脱目标蛋白。
注意事项：
1. 次使用本产品前，请务必详细阅读本说明书；
2. 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作；
3. 在使用本产品前，请务必充分振荡使磁珠保持均匀的悬浮状态；
4. 请选用质量好的移液器吸头和离心管，以免磁珠贴壁或混合过程发生渗漏引起磁珠的损耗；
5. 磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠，可采用移液器反复吹吸或短时漩涡混合使磁珠充分重悬；
6. 用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液，进行取样检测，以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程；
7. 本产品可以重复使用，当纯化性能降低时，建议进行再生处理；
8. 使用过的磁珠重复使用时，建议纯化同种蛋白，纯化不同种类的蛋白时，建议使用新的磁珠；
9. 本产品需与磁性分离器配套使用；
10. 本产品仅供研究使用。

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