SYA074 霍乱弧菌单重荧光PCR检测试剂盒
产品简介
霍乱弧菌单重荧光PCR检测试剂盒的品牌是百奥莱博,是优质的细菌PCR检测试剂盒产品,本制品用于科研目的,我公司的霍乱弧菌单重荧光PCR检测试剂盒品质上佳,经过多年的开发生产,已然非常成熟,欢迎广大新老客户订购。...
产品详细介绍
特别提示:包括霍乱弧菌(O1)单重荧光PCR检测试剂盒在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:霍乱弧菌(O1)单重荧光PCR检测试剂盒
产品货号:SYA074
产品规格:48次/盒
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名称:阪崎肠杆菌单重荧光PCR检测试剂盒
货号:SYA001
规格:48次/盒
本试剂盒适合于增菌培养物、疑似病料及食品中阪崎肠杆菌(ESKZ)的检测。阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是乳制品中近几年新发现的一种致病菌。它是存在自然环境中的一种“条件致病菌”,已被卫生组织和许多确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌,可导致任何年龄层人群的疾病,尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁zuì大,严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎。本方法为荧光PCR检测方法,反应在同一管内连续进行,操作简单,并有效防止了污染,能对样品中或预培养液中的阪崎肠杆菌进行快速检测,具有特异性高、敏感性强和操作简便的特点。
试剂盒组成:
组分 | 规格 |
荧光PCR反应液(ESKZ-qPCR MIX) | 672μL |
DNA抽提液(DNA Extraction ) | 2mL |
酶混合物(DNA Polymerase MIX) | 48μL |
阴性对照(NTC) | 50μL |
阳性对照(ESKZ -PTC) | 50μL |
储存条件:-18℃以下,有效期6个月。
使用方法:
一、样品采集:
?食品样品:样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验(GB/T 4789.40-2008)要求进行。
?血液样品:用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL,注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管,立即混匀。
?粪便样品:取粪便置于灭菌的收集管中送检。
?病灶部位样品:取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
注:上述样品建议经过增菌后,收集培养物用于检测。
二、DNA提取:
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液,按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品,并按照相应试剂盒说明进行操作。
?液体培养物:取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中,8000rpm离心3min,尽量吸弃上清,加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min,取上清5μL进行PCR反应。
?固体培养物:挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min,取上清5μL进行PCR反应。
?粪便样品:挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中,加入0.5mL生理盐水,振荡混匀,13000rpm离心3分钟,弃上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
?其他液体标本:取标本2-3mL,13000rpm离心3min,弃上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀,100℃恒温10min,13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
注:阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取),直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高,建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。
三、检测步骤:
1.试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(ESKZ -qPCR MIX)、酶混合物(DNA Polymerase MIX),室温融化并振荡混匀后,10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:
试剂 | 每个反应加入的量 | N个反应加入的量 |
荧光PCR反应液 | 14 μL | N×14μL |
酶混合物 | 1 μL | N×1 μL |
总量 | 15 μL | N×15μL |
计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10000rpm离心10s,向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL,向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(ESKZ -PTC)5μL,10000rpm瞬时离心10秒。
2.qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 | 50℃ for 2 min | |
预变性 | 1循环 | 95℃ for 10min |
PCR扩增 | 40循环 |
95℃ for 15s 60℃ for 60s |
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团:设置为FAM
四、结果分析:
1.结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。
2.试验成立判定
?阴性对照(NTC):不应产生任何的扩增曲线。
?阳性对照(ESKZ -PTC):均产生扩增曲线,且Ct值≤35。
?以上条件应同时满足,否则,此次试验视为无效。
3.结果判定
?在试验成立的条件下,Ct值≤35的样本为阳性,表明阪崎肠杆菌核酸阳性。
?Ct值显示为无的样本为阴性样本,表明阪崎肠杆菌核酸阴性。
?如果35<Ct值≤40,判为可疑样品。对于可疑样品,先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线,则为可疑阳性,否则判为阴性。
?对于可疑阳性样品,重新抽提核酸,再次进行阪崎肠杆菌real time PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线,判为样本阳性,表明阪崎肠杆菌核酸阳性;否则判为样本阴性。
五、注意事项:
?初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
?所有使用的离心管应高压灭菌,而且必须不含DNA酶。
?PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等),防止实验室污染。
?样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行,以免污染。
?试剂盒里所有物品应视为污染物对待,按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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