WH0200 DNA文库构建试剂盒（illum

DNA文库构建试剂盒（illum由北京百奥莱博供货并提供相关技术服务支持，本品仅用于生物化学研究方面，我公司的DNA文库构建试剂盒（illum品质上佳，经过多年的开发生产，已然非常成熟，欢迎广大新老客户订购。...

特别提示：包括DNA文库构建试剂盒（illumina)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：DNA文库构建试剂盒（illumina)
英文名称：DNA Library Construction Kit（illumina)
产品货号：WH0200
产品规格：24次|96次

  本试剂盒是专门针对于illumina高通量测序平台所优化的DNA文库构建试剂盒。由末端修复（End-Repair Mix）、A尾添加（A-Tailing Mix）和接头连接（Ligation Mix）三个模块构成。与同类试剂不同的是：本产品所含有的模块均为一管式包装，且经特殊工艺加工呈冻干粉状，大增强了试剂稳定性，可在室温条件下运输，保存和实验操作，省去了体系配制，低温保藏等繁琐操作，使得操作更加简便，文库转化效率更高。
  适用范围：适用于illumina高通量测序平台DNA文库构建。
  适用样本量：10ng～1μg DNA。

产品特点：
·冻干粉形式，单管酶促反应，一管完成一步反应。
·高文库转化效率，DNA样本起始量可低至10ng。
·操作简便，省去体系配制，低温保藏等步骤。

试剂盒组成：

组分	24次	96次
End-Repair Mix	24支	96支
A-Tailing Mix	24支	96支
Ligation Mix	24支	96支

保存条件：15～25℃保存，保质期为一年。开封未使用完的组份（末端修复、A尾添加和接头连接等试剂冻干粉）经自封铝箔袋封装后可在室温条件下保存，并在2个月内将所有组份用完。

注意事项请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项
1．操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。
2．请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、EP管进行试验。
3．试验开始前，请清洁操作台，并使用RNA酶及DNA酶清除试剂，如RNase Away处理台面。确保没有RNA酶和DNA的污染。
4．进行文库扩增前，请确保PCR仪已经调试好并处于稳定的状态。
5．试验前请仔细阅读说明书，如果需要暂停试验，或者无需立即进行下游试验。可根据说明书推荐将试验产物保存于-20℃并安排后续试验。

操作流程：



使用本试剂盒以大肠杆菌DNA为例，样本DNA起始量与经qPCR定量得到的文库DNA量之间呈现良好的线性关系。

操作步骤：

一、DNA片段化
本试剂盒不包含DNA片段化相关试剂。对于DNA的片段化过程，客户可在超声处理、化学处理和酶处理等常用方法中选择，具体操作请参考相关产品说明。

二、末端修复
1．沿锡箔纸封口袋顶部切口位置撕开试剂包装袋。
2．取出一支管盖呈蓝色的1.5ml离心管用于末端修复反应。每支1.5ml离心管中所含的冻干粉试剂可供一次文库构建反应使用。
3．如有需要，可瞬时离心以确保冻干粉聚集于离心管底。
4．按下表建立末端修复反应体系：

成分	使用量
双链DNA片段（10ng-1μg)	X μl
ddH2O	100-X μl

5．用移液器轻柔吸打6～8次混匀反应体系。
6．20℃孵育30min。
7．使用AMPure@ XP磁珠纯化末端修复产物。
8．纯化开始前将AMPure@ XP磁珠平衡至室温。
9．使用前将AMPure@ XP磁珠涡旋使其充分悬浮。
10．若反应管与磁力架不兼容，可将末端补平反应液转移至与磁力架兼容的离心管中。
  注：此离心管须能够容纳260μl液体。
11．每100 μl末端修复反应液中加入160 μl AMPure@ XP磁珠，吸打混匀至少5次。
12．室温放置5 min。
13．将含磁珠的反应液置磁力架上3 min，待溶液变清澈。
14．用移液器分两次吸除上清，每次128 μl。注意在吸入上清的过程中不要扰动磁珠，除去上清后管底剩余少量液体不影响后续试验。
15．保持反应管置于磁力架上，向反应管管底轻柔加入200 μl 80%乙醇（注意不要扰动磁珠），室温孵育30 sec。
16．小心去除80%乙醇（~200 μl），不要扰动磁珠。
17．用80%乙醇重复洗涤一次（步骤15-16）。
18．将反应管瞬时离心后置于磁力架上，使用<20 μl量程的移液器小心去除管底残留的乙醇。
19．将反应管开盖置于磁力架上，室温干燥5 min
20．将反应管从磁力架上取下，加入52.5 μl洗脱缓冲液（10mM Tris-HCl,pH8.0;10mM Tris,0.1mM EDTA,pH 8.0或者去离子水）。用移液器吸打使磁珠悬浮。
21．将反应管置于磁力架上3 min，待溶液澄清。小心吸取上清至新离心管。
22．立刻进入A尾添加程序或将产物保存于-20℃ （末端补平产物可在-20℃保存7天）。

三、A尾添加
1．沿锡箔纸封口袋顶部切口位置撕开试剂包装袋。
2．取出一支管盖呈黄色的1.5ml离心管用于A尾添加反应。每支1.5ml离心管中所含的冻干粉试剂可供一次文库构建反应使用。
3．如有需要，可瞬时离心以确保冻干粉聚集于离心管底。
4．向反应管内加入50 μl末端修复后的DNA纯化产物（末端修复之步骤22）。
5．用移液器轻柔吸打6～8次混匀反应体系。
6．30℃孵育30min。
7．使用AMPure@ XP磁珠纯化A尾添加产物。
8．纯化开始前将AMPure@ XP磁珠平衡至室温。
9．使用前将AMPure@ XP磁珠涡旋使其充分悬浮。
10．若反应管与磁力架不兼容，可将A尾添加反应液转移至与磁力架兼容的离心管中。
  注：此离心管须能够容纳200 μl液体。
11．每50 μl末端修复反应液中加入90 μl AMPure@ XP磁珠，吸打混匀至少5次。
12．室温放置5 min。
13．将含磁珠的反应液置磁力架上3 min，待溶液变清澈。
14．用移液器吸除上清，约135 μl。
注：吸入上清的过程中不要扰动磁珠，除去上清后管底剩余少量液体不影响后续试验。
15．保持反应管置于磁力架上，向反应管管底轻柔加入200 μl 80%乙醇（注意不要扰动磁珠），室温孵育30 sec。
16．小心去除80%乙醇（~200 μl），不要扰动磁珠。
17．用80%乙醇重复洗涤一次（步骤15-16）。
18．将反应管瞬时离心后置于磁力架上，使用<20 μl量程的移液器小心去除管底残留的乙醇。
19．将反应管开盖置于磁力架上，室温干燥5 min。磁珠干燥期间请计算接头连接过程中所需的DNA量（X）以及接头用量（接头连接步骤中第4步）。
  注：文库DNA与接头在适当的摩尔比范围内可以增加接头连接效率，进而提高文库质量和丰度。另外，使用过小体积溶液洗脱会造成DNA得率显著降低，故应使X≥20 μl。
20．将反应管从磁力架上取下，加入（X+2.5) μl洗脱缓冲液（10mM Tris-HCl,pH8.0;10mM Tris,0.1mM EDTA,pH 8.0或者去离子水）。用移液器吸打使磁珠悬浮。
21．将反应管置于磁力架上3 min，待溶液澄清。小心吸取上清至新离心管。
22．直接进入接头连接步骤或将产物保存于-20℃（添加A尾后的DNA产物可在-20℃保存7天）。

四、接头连接
1．沿锡箔纸封口袋顶部切口位置撕开试剂包装袋。
2．取出一支管盖呈紫色的1.5ml离心管用于末端修复反应。每支1.5ml离心管中所含的冻干粉试剂可供一次文库构建反应使用。
3．如有需要，可瞬时离心以确保冻干粉聚集于离心管底。
4．按下表建立接头连接反应体系：

成分	使用量
添加A尾后DNA纯化产物	X μl
DNA接头*	Y μl
总体系	50μl

注：本试剂盒中不含DNA接头。接头用量需根据文库DNA片段用量进行调整。推荐接头产品为Single-Indexed Adapter （Illumina? Platforms)（WH0206-01/02/03）。该产品说明书中详细给出了不同情况下，DNA片段与接头的zuì佳摩尔比，客户可进行参考。若使用其他公司的接头产品，则需参考其说明书操作。
5．用移液器轻柔吸打6～8次混匀反应体系。
6．20℃孵育15 min。
7．使用AMPure@ XP磁珠纯化末端修复产物。
8．纯化开始前将AMPure@ XP磁珠平衡至室温。
9．使用前将AMPure@ XP磁珠涡旋使其充分悬浮。
10．若反应管与磁力架不兼容，可将末端补平反应液转移至与磁力架兼容的离心管中。
  注：此离心管须能够容纳200 μl液体。
11．每50 μl末端修复反应液中加入50 μlAMPure@ XP磁珠，吸打混匀至少5次。
12．室温放置5 min。
13．将含磁珠的反应液置磁力架上3 min，待溶液变清澈。
14．用移液器吸除上清，约95 μl。
  注：在吸入上清的过程中不要扰动磁珠，除去上清后管底剩余少量液体不影响后续试验。
15．保持反应管置于磁力架上，向反应管管底轻柔加入200 μl 80%乙醇（注意不要扰动磁珠)，室温孵育30 sec。
16．小心去除80%乙醇（~200 μl），不要扰动磁珠。
17．用80%乙醇重复洗涤一次（步骤15-16）。
18．将反应管瞬时离心后置于磁力架上，使用<20 μl量程的移液器小心去除管底残留的乙醇。
19．将反应管开盖置于磁力架上，室温干燥5 min。磁珠干燥期间请计算片段筛选过程中所需的DNA量（Z）。
  注：由于不同的片段选择方法所需的上样量不同，用户可以根据后续片段筛选方法确定接头连接产物的洗脱体积（Z+2.5 μl）。其中，推荐Z的取值范围为：20≤Z≤100。如果不进行片段筛选，则推荐再次使用AMPure@ XP磁珠进行纯化以降低接头污染（50 μl接头连接产物加入50 μl磁珠，Z=50 μl）。如果不明确如何选择Z值，请参阅说明书第五部分。
20．将反应管从磁力架上取下，加入（Z+2.5) μl洗脱缓冲液（10mM Tris-HCl,pH8.0;10mM Tris,0.1mM EDTA,pH 8.0或者去离子水）。用移液器吸打使磁珠悬浮。
21．将反应管置于磁力架上3 min，待溶液澄清。小心吸取上清至新离心管。
22．小心吸取上清Z μl至新离心管，直接进入说明书第五部分或将产物保存于-20℃（接头连接后的DNA产物可在-20℃保存7天）。

五、片段筛选
若使用Illumina平台进行测序或进行基因组测序，文库DNA片段平均大小应为400 bp（包含接头）。片段筛选步骤即旨在特异性地回收得到这部分片段，而去除过大或过小的双链及单链DNA片段。以下是常用的片段筛选方法，以及使用这些方法时所需要的连接产物体积（Z）。
1．琼脂糖凝胶回收（Z=20 μl）；
2．Sage Science Pippin PrepTM（Z=30 μl）；
3．Life TechnologiesTM E-Gel@ SizeSelectTM Gels（Z=20 μl）；
4．基于磁珠的片段筛选方法（Z=100 μl）。
注：片段筛选步骤一般在接头连接后进行，以控制文库中DNA片段大小。但用户也可以根据自身需要在末端修复完成后即进行片段筛选。

六、文库扩增
本试剂盒不含PCR试剂及引物。用户需要自行选择PCR试剂，并根据文库DNA上样量确定扩增循环数。PCR结束后，可使用AMPure@ XP磁珠（Cat# A63881）对产物进行纯化，并使用凝胶电泳、Qubit@、qPCR以及Angilent生物分析仪对纯化后的DNA文库进行分析。推荐试剂为NGS文库富集试剂（WH0210）。

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名称：E2F-5 mRNA原位杂交试剂盒
货号：ZN0430
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human,rat,mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.E2F-5 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地gāo辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地gāo辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
E2F-5的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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