BTN100212 一管式点突变试剂盒

一管式点突变试剂盒是高品质的基因结构和功能产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于生化实验研究等领域，本品质量稳定，价位合理，需要一管式点突变试剂盒等基因结构和功能产品的客户，请到我公司官网联系我们。...

特别提示：包括一管式点突变试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：一管式点突变试剂盒
英文名称：One-Tube Mutagenesis Kit
产品货号：BTN100212
产品规格：10次

基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链DNA 模板，而得到单链DNA 模板又需要先将基因克隆到类似M13 这种载体中，操作过程冗长。为了克服这些缺点，本公司将突变位点设计到一对互补的引物中，用高保真扩增质粒模板，然后用Dpn I 去除原始的甲基化模板，新合成的DNA 通过互补形成带切口的双链质粒，直接用于转化感受态细菌。

产品特点：
1. 直接使用质粒DNA作为模板，免去了制备单链DNA的步骤。
2.基于高保真PCR，对模板DNA 序列没特殊要求，可以用于突变任何序列。同时对模板的需求量很少。
3.一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。
4. 使用Dpn I 去除未突变模板，突变效率高达90%。
5.可用于制备点突变，缺失突变和插入突变。
6. 本产品A型适用于8 kb以下，B型适用于8-15 kb。

试剂盒组成：

成分	10T(A型)	10T(B型)
高保真酶A型	10μl	无
高保真酶B型	无	10μl
5×高保真酶Buffer A型	100μl	无
5×高保真酶Buffer B型	无	100μl
dNTP(2.5mM each)	50μl	50μl
Dpn I酶	10μl	10μl
超纯水	1ml	1ml

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、引物设计及注意事项
用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。
1. 共需设计两条完全互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点zuì好放在引物的中心。可以先集中设计一条，然后就可得互补的另一条引物。
2.引物的长度通常为25-45个碱基。引物中突变位点任何一侧都必需满足Tm大于45的条件，Tm 计算方式为Tm=4×(GC 碱基数)＋2×(AT 碱基数)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就达到此标准，它的突变位点AAG 所放位置使左侧Tm＝46；右侧Tm＝48，均大于45。
3. 尽量把引物的GC含量控制在40％-60％，结尾的1-3个碱基zuì好是G或C。
4. 尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。
5. zuì好使用经过PAGE 纯化的引物或更高纯度的引物。

二、待突变模板质粒的选择
1. 必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变，否则Dpn I 不能把没有酶切的质粒DNA 切除，产生大量的假阳性。常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。不能使用JM110和SCS110以及其它dcm-菌种。
2. 待突变质粒和目的基因的GC含量应该在40-55％，没有任何GC含量超过70%、长度在50bp以上的区域。如果质粒GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果突变位点在高GC 区，则可以使用高GC 专用PCR反应试剂。

三、基因定点突变反应
1.在一个塑料离心管中加入下列成分：

待突变模板质粒	0.1-0.5μg
5×高保真酶Buffer	10μl
引物一(10-20 uM)	1μl
引物二(10-20 uM)	1μl
dNTP Mix(2.5mM each)	4μl
补水到	49μl

2. 加入1μl高保真DNA聚合酶，混匀，如果PCR仪没有热盖则需要加少量石蜡油。放入PCR仪器中按下面参数进行PCR：

步骤	温度	时间	循环数
变性	95℃	1min	1次
PCR	95℃	40s	18次
	60℃	1min
	68℃	1min/Kb
延伸	72℃	10min	1次
保存	4℃	长时间保持

四、Dpn I消化
PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1μL Dpn I内切酶(该酶在甘油保存液中会下沉到管底，故用前需要充分混匀)。DpnI可以酶切双链都被甲基化的模板质粒，也能降解一条链被甲基化的双链质粒。混匀后37℃孵育2小时后样品可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。

五、转化、挑克隆鉴定：
每100 微升感受态细菌(转化效率必须在107/μg以上)中可以加入5-10微升经过Dpn I 消化后的突变产物，按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作。如果PCR 使用了石蜡油，在转化时千万别把它带入转化反应，否则会严重影响转化效率。
在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌全部涂布到含有适当抗生素的平板上培养过夜。通常会得到50个以下的克隆，可按常规方法制备质粒并测序。

六、常见问题：
1.转化后没有克隆或克隆数少：
(1)感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107/μg。
(2)把Dpn I 消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。
(3)优化基因定点突变中的PCR参数。可以把zuì初的95℃变性时间延长为2分钟，循环中95℃变性的时间延长至1分钟，把循环中的68℃的延伸时间改为1.5分钟/kb 至2分钟/kb，退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。
(4)引物设计有问题。通过突变反应中的PCR 没有很好地扩增出预期的突变质粒。
2.有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克隆：
使用的待突变的模板质粒量过多，导致Dpn I 消化时不完全，可减少质粒用量。
3. 有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：
(1)引物设计不佳，退火温度过低，导致引物退火到错误的地方。
(2)引物质量较差，没有经过PAGE 纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物，容易导致非预期的突变。

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名称：ACVR2A mRNA原位杂交试剂盒
货号：ZN0022
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.ACVR2A mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高xīn 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高xīn：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
ACVR2A的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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