WH0208 DNA片段化/末端修复/加dA尾

北京百奥莱博供应的DNA片段化/末端修复/加dA尾用于科研试验，本产品质量好，且具价格，深为用户称道，了解更多DNA片段化/末端修复/加dA尾等基因结构和功能产品请联系我司咨询订购。...

特别提示：包括DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂（Illumina)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂（Illumina)
英文名称：Fragmentation/End repair/dA-tailing Reagent（Illumina)
产品货号：WH0208
产品规格：24次|96次

本制品是专门针对于illumina高通量测序平台所优化的预混酶模块，包含了DNA片段化、末端修复以及3"端dA尾添加所需的所有酶类，可将双链DNA片段化为小片段，并分别在片段化DNA两端添加5"-P和3"端dA，所得产物无需纯化，可直接通过Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）用于adapter的连接。该模块采用一步法的反应流程，省去了多步纯化步骤，可对微量DNA样本进行、快速的片段化、末端修复及dA尾添加，操作更加简便，文库转化效率更高。

适用范围：用于双链DNA的片段化、末端修复及3"端添加dA，适用于illumina高通量测序平台DNA文库构建。
适用样本量：1ng~1μg DNA。

产品特点：
·单管酶促反应，一步完成双链DNA的片段化、末端修复、dA添加反应。
·高文库转化效率，DNA样本起始量可低至1ng。

产品组成：

组分	24次	96次
5×FEA Enzyme Mix	240μl	960 μl
10×FEA Reaction Buffer	120 μl	480 μl
FEA Enhance	120 μl	480 μl
Nuclease-Free ddH2O	1ml	4×1ml

保存条件：-25~-15℃保存，避免反复冻融，保质期为一年。

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项）
1．操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。
2．请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、EP管进行试验。
3．试验开始前，请清洁操作台，并使用RNA酶及DNA酶清除试剂，如RNase Away处理台面。确保没有RNA酶和DNA的污染。
4．进行文库扩增前，请确保PCR仪已经调试好并处于稳定的状态。
5．试验前请仔细阅读说明书，如果需要暂停试验，或者无需立即进行下游试验。可根据说明书推荐将试验产物保存于-20℃并安排后续试验。
6．由于使用本品所进行的片段化过程为酶促反应，故片段化过程对反应温度、反应时间、体系配制以及DNA上样量等因素较为敏感。强烈推荐用户按照本说明书所述步骤及优化的反应参数（如反应时间等）进行试验。

推荐使用的其他试剂：
1.Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）
2.NGS Library Amplification Reagent（WH0210-01/02）
3.Single-Index Adapter（Illumina)（WH0206-01/02/03）
4.BECKMAN Agencourt AMPure XP磁珠

操作步骤：

一、试验准备
1.在开始实验前，明确核酸的浓度及纯度至关重要，推荐上样量1ng~1μg DNA。DNA需溶解于以下溶液中：去离子水、10mM Tris、Buffer EB或LoTE（0.1×TE）等。
注意：
?确定上样DNA浓度至关重要，尤其在上样量低于100 ng时。推荐使用Qubit、Picogreen或者其他染料法对DNA浓度进行准确定量。
?请确认DNA溶液中不含阳离子及螯合剂。如果DNA溶解于1×TE或不确定DNA溶液中的EDTA浓度，请参照附录Ⅰ所述步骤，使用BECKMAN公司的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化或参照附录Ⅲ进行片段化处理。
2.将各试剂置于冰上，5×FEA Enzyme Mix融化后用手指后轻弹混匀，不要涡旋。其余试剂可短暂涡旋混匀。

二、试验步骤
1.照下表设置PCR仪反应程序。开启热盖，热盖温度设置为70℃。

操作步骤	温度	时间
1	4℃	1min
2	32℃	3-24min*
3	65℃	30min
4	4℃	保持

*注：确切的片段化反应时间需要根据DNA的实际上样量进行优化。下表1中列出10ng、100ng和1000ng上样量DNA片段化所需的时间，用户可以依据此时间进行调整。调整过程中，我们推荐额外设置一个反应时间延长3min以及一个缩短3min的对照。这样有助于确定切割至所需片段大小时所需要的准确反应时间。关于片段化时长的更多建议，请参考附录II。

表1：片段化时间选择表（32℃)

DNA主峰大小	250bp	350bp	450bp	550bp
10ng DNA上样量	24min	16min	14min	10min
100ng DNA上样量	16min	10min	8min	6min
1000ng DNA上样量	14min	8min	6min	4min

2.请按下表配制反应体系，冰上操作，各组分加入后，请轻柔吸打混匀，注意不要涡旋。

  当DNA上样量＞10 ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5 μl
DNA样本	X μl
Nuclease-Free ddH2O	（35-X) μl
总体积	40 μl

  当DNA上样量≤10 ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5 μl
DNA样本	X μl
FEA Enhancer	2.5 μl
Nuclease-Free ddH2O	（32.5-X) μl
总体积	40 μl

  注：对于多个反应，请计算所需试剂的总体系并在此基础上增加体系10%，以避免因溶液转移过程中挂壁损失而造成分装反应数不足的问题。
3.取1个新的200 μl薄壁管置冰上，向管中加入10 μl 5×FEA enzyme Mix，随后将（2）中反应体系转移40 μl至同一薄壁管中，轻柔吸打混匀6-8次。
4.瞬时离心薄壁管，立刻置于已预冷至4℃的PCR仪中，并启动反应程序。
5.当反应程序结束后，将薄壁管从PCR仪中取出并置冰上。
6.立即进入接头连接步骤，为保证连接效率，推荐使用Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）。

附录I：DNA样品溶液中二价盐离子以及EDTA的去除
请参照供应商提供的步骤进行纯化。
1.若DNA溶液体积小于50 μl，请用无核酸酶的去离子水补足体积至50 μl。
2.加入90 μl（1.8倍体积）完全涡旋混匀的Agencourt AMPure XP磁珠至DNA溶液中，吸打混匀。若DNA溶液体积大于50 μl，请根据DNA溶液的实际体积，加入1.8倍体积完全涡旋混匀的Agencourt AMPure XP磁珠。
3.室温孵育5 min后，将反应管置于磁力架上2~4 min收集磁珠，小心去除上清液。
4.用200 μl 80%乙醇洗涤磁珠，将反应管置于磁力架上收集磁珠，弃去上清。重复此洗涤步骤一次。
5.将反应管置于磁力架上，打开离心管盖于室温条件下晾置10 min或至磁珠干燥为止。
6.加入45 μl 10mM Tris-HCl（pH8.0）使磁珠完全悬浮后，置磁力架上2 min。待磁珠贴壁后小心转移42.5 μl上清至新的离心管。
7.使用Quibit、Picogreen或其他荧光定量方法测定纯化后的DNA浓度。

附录II：优化片段化处理时间
片段化反应时间需要根据DNA上样量进行优化，参考图1所示曲线选择反应时间。优化过程请使用将实际用于测序的DNA样品，这将有助于在测序时保证片段化过程的可重复性。初次优化时，我们推荐添加2个额外的反应时间，即依据图中曲线选择反应时间后，在此时间基础上分别延长和缩短3min。若对片段大小有较的要求，可在此基础上继续对反应时间进行微调。在实际操作中，若DNA上样量≥10 ng，用户可在片段化步骤完成后即对反应效果进行评价。具体方法为使用1.8倍体积AMPure@XP磁珠对反应产物进行纯化，并将其溶解于10 μl Tris溶液或去离子水。然后使用Bioanalyzer High Sensitivity试剂盒确定片段分布。
对于上样量＜10 ng的片段化反应，为了节省反应时间，我们推荐在每个反应体系中（50 μl）添加2.5 μl的FEA Enhancer。反应时间则推荐使用图1中将10 ng DNA切割至特定片段大小所需时间的一半。例如：若期望DNA片段集中于350 bp，则加入FEA Enhancer后反应10 min左右即可。

图1不同DNA上样量经片段化后产出片段大小与反应时间对应曲线

附录III：1×TE溶液中DNA的片段化/末端修复/A尾添加
当DNA溶解于1×TE溶液中时，请参照以下步骤进行DNA的片段化/末端修复/A尾添加反应。
1．按照下表设置PCR仪反应程序。请确认在反应中开启热盖。如有可能，请将热盖温度设置为70℃。DNA上样量为1-1000ng。

反应步骤	反应温度	反应时间
1	4℃	1min
2	32℃	5-35min*
3	65℃	30min
4	4℃	保持

*注：反应时间需根据DNA的实际上样量进行优化。若DNA上样量≥10 ng，反应体系中加入2.5 μl FEA Enhancer，推荐使用25 min作为起始反应时间，此时产生的片段主要集中于300-500 bp；若DNA上样量＜10 ng，反应体系中加入5 μl FEA Enhancer，则推荐使用15 min作为起始时间，此时片段集中于300 bp。若需要进行调整，则请以3min为单位，在原反应时间基础上进行增减，直至得到所需要的片段大小。

2．为了保证良好的试验效果，请严格按照以下说明进行操作。在一个新的薄壁管中参照下表配制反应体系，此步请于冰上操作，配置好的反应体系经轻柔吸打混匀，注意不要涡旋震荡。

  当DNA上样量≥10ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5μl
DNA样本	X μl
FEA Enhancer	2.5μl
Nuclease-Free ddH2O	（32.5-X) μl
总体积	40μl

  当DNA上样量＜10ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5μl
DNA溶液	X μl
FEA Enhancer	5μl
Nuclease-Free ddH2O	（30-X) μl
总体积	40μl

1．取新的PCR薄壁管置冰上，加入10 μl 5×FEA Enzyme Mix。随后将上一步准备好的反应体系转移40 μl至同一薄壁管中。轻柔吸打混匀6-8次。注意操作过程中请保持反应管置于冰上。
2．将薄壁管瞬时离心后，立刻转移至已预冷至4℃的PCR仪中，并启动反应程序。
3．当反应程序结束，PCR仪温度降至4℃后，将薄壁管从PCR仪中取出并置冰上。立即进入接头连接步骤，为保证连接效率，推荐使用Fast Ligation Reagent（WH0209-01/02）。

根据您的关注的DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂（Illumina)，您可能还对以下产品有需求：



名称：基因定点突变试剂盒
货号：YT027
规格：10次
本试剂盒可以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)。

本试剂盒是一个利用目前zuì新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。只需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于Dpn I的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图1)。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。



参考上图，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。

本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。

试剂盒组份：

Pfu DNA Polymerase	10μl
Reaction Buffer(10X)	100μl
dNTP Mix(2.5mM each)	50μl
Dpn I	10μl
DH5α 甘油菌	200μl
Nuclease-Free Water	1ml

储存条件：-20℃，有效期一年。

使用说明：

1. 引物设计：
用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：
(1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
(2) 引物的长度通常为25-45个碱基。
(3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足 4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数) ≥45。但引物也不宜过长，否则通常会形成非常稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。
例如引物为agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则
左侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X7＝46≥45
右侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X8＝48≥45
(4) 在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40％-60％。
(5) 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可以通过一些软件进行分析。
(6) zuì好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。

2. 引物的配制：
如果合成得到的一个引物A的量是20nmol，另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水，配制成浓度为100µM，在引物B中加入190微升水也配制成浓度为100µM。吸取20微升100µM引物A和20微升100µM引物B到一新的离心管中，再加入160微升水，混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10µM each)。

3. 待突变模板质粒的选择：
选择GC含量在40-55％的待突变模板质粒，并且每一个50bp左右的局部GC含量zuì好也不超过70%。如果GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量zuì好也在40-55％的范围，并且每一个50bp左右的局部GC含量zuì好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板，或者有局部高GC含量的质粒模板，请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。
必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。

4. 基因定点突变反应：
(1) 如下设置基因定点突变反应体系：
Nuclease-Free Water———>?µl
Reaction Buffer (10X)——>5µl
引物 (10µM each)————>2µl
dNTP Mix (2.5mM each)——>4µl
待突变模板质粒(0.5µg)——>?µl
总体积——————————>49µl
按照上面的顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中，根据待突变模板质粒的量，计算出需加入的Nuclease-Free Water的量，使总体积为49微升。适当混匀后，加入 1 ul Pfu DNA Polymerase，混匀。如果用的PCR仪没有热盖，在反应体系上加入一滴矿物油(mineral oil)以防止蒸发。
(2) 按照如下参数设置PCR仪：

步骤	循环数	温度	时间	说明
1	1	95℃	1分钟	zuì初变性
2	18	95℃	40秒	变性
		60℃	1分钟	退火
		68℃	1分钟/kb	延伸
3	1	72℃	10分钟	延伸、补全
4	1	4℃	长时间保持	暂时存放

说明：上面表格中1分钟/kb表示，如果待突变的质粒为6kb，那么68℃的延伸时间为6分钟。

5. Dpn I消化：
PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1微升Dpn I，混匀后37℃孵育1小时。37℃孵育可以在PCR仪上进行，也可以在水浴锅中进行。Dpn I消化完毕后可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。

6. 转化、挑克隆鉴定：
感受态细菌的转化效率必需至少在107以上，否则很难得到克隆。根据所使用的感受态细菌，加入尽量多的经过Dpn I消化后的突变产物用于转化。通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过Dpn I消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作，在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌，全部涂布到含有适当抗生素的平板上，培养过夜。通常会得到50个以下的克隆。如果发现克隆有上千个，那么肯定是有什么地方出了问题。
对于得到的克隆，可以先挑克隆小抽酶切鉴定。以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小与预期结果是否相符。
取3-5个酶切鉴定正确的克隆去测序，以zuì终确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。通常大约每2个克隆中会得到一个预期的突变克隆。但有时也可能会因为随机因素，会测序了3-5个克隆才得到一个预期的突变克隆。

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货号	名称	规格
WE0228	二代测序DNA快速建库试剂盒(Ion Torrent平台)	24次|96次
ZN0141	BMP-8 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0202	Catenin β mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0239	CD1C mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0254	CD44V9 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0520	FIH mRNA原位杂交试剂盒	100T

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