WH0201 adapter快速连接试剂（il

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特别提示：包括adapter快速连接试剂（illumina)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：adapter快速连接试剂（illumina)
英文名称：Fast Ligation Reagent
产品货号：WH0201
产品规格：24次|96次

本制品是专门针对于illumina高通量测序平台所优化的预混酶模块。使用本模块可以将3"端带有dA尾的DNA片段与adapter进行快速连接。与常规方法比较，本模块采用了一步法反应流程，BaiSeq Fragmentation/DNA末端修复/加dA尾试剂或BaiSeq DNA末端修复/加dA尾试剂反应后所获得的片段后DNA，无需磁珠纯化，可使用本模块直接与adapter进行连接，省去了多步磁珠纯化步骤，操作更加简便，文库转化效率更高。适用样本量：0.25ng～1μg DNA。

产品特点：
·无需磁珠纯化，可直接将DNA adapter与带有dA-Tailing的DNA片段连接。
·连接，可进行微量样本的DNA adapter连接。

适用范围：
将DNA adapter与3"端添加dA的DNA文库片段的快速连接（如Fragmentation/DNA末端修复/加dA尾试剂或DNA末端修复/加dA尾试剂处理后的产物）

试剂盒组成：

组分	24次	96次
DNA Ligase	240μl	960μl
5×Ligation Buffer	500μl	2×1ml
Nuclease-Free ddH2O	1ml	2×1ml

保存条件：-25～-15℃保存，避免反复冻融，保质期为一年。

注意事项（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项）
1．操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。
2．请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、EP管进行试验。
3．试验开始前，请清洁操作台，并使用RNA酶及DNA清除试剂处理台面，确保没有RNA酶和DNA的污染。
4．进行文库扩增前，请确保PCR仪已经调试好并处于稳定的状态。
5．试验前请仔细阅读说明书，如果需要暂停试验，或者无需立即进行下游试验。可根据说明书推荐将试验产物保存于-20℃并安排后续试验。

操作步骤：

1．DNA片段经Fragmentation/DNA末端修复/加dA尾试剂或DNA末端修复/加dA尾试剂处理，完成A尾添加反应后，向此50μl反应体系中加入Y μl的adapter溶液，轻柔吸打混匀后置冰上。
  注意：本试剂盒中不含测序DNA adapter，推荐配合Single-Indexed Adapter（Illumina? Platforms) （WH0206)使用，为了达到较高的连接效率，我们推荐反应体系中DNA片段与adapter的摩尔比在10:1至200:1之间，详见WH0206产品说明书。
2．按照下表所示各组分用量配制反应体系，并将配制完成的反应体系轻柔混匀后置于冰上。

成分	使用量
5×Ligase Buffer	20μl
DNA Ligase	10μl
Nuclease-Free ddH2O	（20-Y)μl

  注：对于多个样品，请计算所需试剂的总体积并在此基础上额外添加10%的试剂，以避免分装过程中枪头挂壁损失而导致试剂体积不足。
3．将此配制好的（50-Y）μl连接反应液加入至第1步准备的反应液中，轻柔吸打混匀，置于20℃中反应15min。
  注意：此步骤如果使用PCR仪进行反应，请不要启动热盖。
4．向反应产物中加入0.8×体积（80 μl）Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，具体步骤如下：
①将AMPure@XP磁珠置于室温平衡20 min。
②涡旋使磁珠充分悬浮，加入80 μl Agencourt AMPure XP磁珠至步骤3溶液中，充分吸打混匀。
③室温孵育5 min，将反应管置于磁力架上1～2 min。待磁珠完全贴壁后，用移液器吸弃上清。
④向反应管内加入200 μl 80%乙醇，轻轻震荡混匀，洗涤磁珠，并用磁力架回收磁珠，弃上清。
⑤将含有磁珠的反应管置磁力架上，开盖室温放置5~10 min，至晾干。
  注：不要过分干燥磁珠，否则会造成得率降低。
⑥加入25 μl 10mM Tris-HCl （pH 8.0)至离心管内并使用移液器轻轻吸打磁珠至充分悬浮。将反应管放置于磁力架上1~2 min，只使磁珠完全贴壁后，转移约20 μl上清至新的离心管中，用于后续的PCR富集实验。
  注：如果需要对DNA片段大小进行选择，则请参照DirectFast DNA Library Kit （illumina) （WH0203)说明书中片段分选步骤进行操作。如果连接产物无需进行PCR富集，可在步骤g)中加入12.5 μl的10mM Tris-HCl （pH 8.0)洗脱DNA，并转移10 μl纯化后的DNA用于后续的试验反应。如不立即使用，请将样品冻存于-20℃保存。

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名称：Androgenbinding protein/ABP mRNA原位杂交试剂盒
货号：ZN0057
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human,rat,mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.Androgenbinding protein/ABP mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗dì高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗dì高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
Androgenbinding的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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