WH0207 DNA片段化试剂

DNA片段化试剂是高品质的基因结构和功能产品，由北京百奥莱博供应，本产品仅用于生物化学研究方面，本产品质量好，且具价格，深为用户称道，了解更多DNA片段化试剂等基因结构和功能产品请联系我司咨询订购。...

特别提示：包括DNA片段化试剂在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：DNA片段化试剂
英文名称：DNA Fragmentation Reagent
产品货号：WH0207
产品规格：24次|96次

本制品为高通量测序平台文库构建配套试剂盒，用于文库构建前的大片段DNA片段化。模块利用时间依赖型酶促反应的原理，根据不同的作用时间将双链DNA随机切割成200~500 bp的片段，所得片段为平末端双链DNA片段，5"端基团含有5"-P，3"端基团含有3"-OH，可直接进行后续的dA或adapter添加。通过本制品对双链DNA随机的切割，表明本产品不具碱基偏好性，且不同类型切割DNA片段的测序覆盖率与机械切割一致。

适用范围：为构建NGS文库制备片段化的双链DNA。
适用样本量：1ng~1μg DNA

产品特点：
·无需特殊仪器设备，通过酶促反应简便快速的片段化双链DNA。
·使用灵活，通过调整片段化时间，灵活调整DNA片段化长度。
·反应，单个反应体系即可完成1ng～1μg DNA样本的片段化。

产品组成：

组分	24次	96次
5×Frag Enzyme Mix	240μl	960μl
10×Frag Buffer	120μl	480μl
Nuclease-Free ddH2O	1ml	4×1ml

保存条件：-25~-15℃保存，避免反复冻融，保质期为一年。

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项）
1．操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。
2．请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、EP管进行试验。
3．试验开始前，请清洁操作台，确保没有RNA酶和DNA的污染。
4．进行文库扩增前，请确保PCR仪已经调试好并处于稳定的状态。
5．试验前请仔细阅读说明书，如果需要暂停试验，或者无需立即进行下游试验。可根据说明书推荐将试验产物保存于-20℃并安排后续试验。

推荐使用的其他试剂：
1.DNA末端修复/加dA尾试剂（WH0209-01/02)
2.adapter快速连接试剂（WH0201-01/02）
3.NGS文库富集试剂（WH0210-01/02)

操作步骤：

一、试验准备
1.在开始实验前，明确核酸的浓度及纯度至关重要，推荐DNA上样量为1ng~1μg。DNA需溶解于以下溶液中：去离子水、10mM Tris、Buffer EB或LoTE（0.1×TE）等。
注意：
?确定上样DNA浓度至关重要，尤其在上样量低于100 ng时。推荐使用Qubit、Picogreen或者其他染料法对DNA浓度进行准确定量。
?请确认DNA溶液中不含阳离子及螯合剂。如果DNA溶解于1×TE或不确定DNA溶液中的EDTA浓度，使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化。
2.将各试剂置于冰上，5×Frag Enzyme Mix融化后用手指后轻弹混匀，不要涡旋。其余试剂可短暂涡旋混匀。

二、试验步骤
1.照下表设置PCR仪反应程序。开启热盖，热盖温度设置为70度。

操作步骤	温度	时间
1	4℃	1min
2	32℃	3-22min*
3	65℃	30min
4	4℃	保持

*注：确切的片段化反应时间需要根据DNA的实际上样量进行优化。下表1中列出100ng DNA片段化所需的时间。用户可以依据此时间进行调整。调整过程中，我们推荐额外设置一个反应时间延长3min以及一个缩短3min的对照，这样有助于确定切割至所需片段大小时所需要的准确反应时间。

表1：片段化时间选择表

	片段化时间（min)（32℃)
DNA主峰大小	200bp	300bp	400bp	500bp
100ngDNA上样量	15	8	5	3.5

图1.100ng大肠杆菌基因组DNA片段化图谱（3～22 min）

2．在薄壁管中按下表配制反应体系，冰上操作，各组分加入后，请轻柔吸打混匀，注意不要涡旋。

成分	用量（μl)
10×Frag Buffer	5
DNA样本	X
Nuclease-Free ddH2O	（35-X)*
总体积	40

  *注：对于多个反应，请计算所需试剂的总体系并在此基础上增加体系10%，以避免因溶液转移过程中挂壁损失而造成分装反应数不足的问题。
3．向薄壁管中加入10μl 5×Frag Enzyme Mix，轻柔吹打6～8次，不要涡旋。
  注：此过程需一直处于冰浴中进行。
4．将薄壁管短暂离心，收集溶液至管底后，立即转移至4℃预冷的PCR仪中，启动步骤1中的反应程序。
5．当反应程序结束，PCR仪温度降至4℃后，将薄壁管从PCR仪中取出并置冰上。立即进行下一步实验操作。

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名称：CCK mRNA原位杂交试剂盒
货号：ZN0219
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：rat
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.CCK mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地gāo辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地gāo辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
CCK的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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