HR0131 植物核蛋白/细胞器蛋白提取试剂盒
本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解植物核组分。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物,阻止了蛋白酶对蛋白的降解,为提取高纯度的蛋白提供了保证。本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等等下游蛋白研究。本试剂盒提取的蛋白为具有天然...
产品特点:
● 使用方便。
● 将蛋白提取的时间缩短至1小时。
● 含蛋白稳定剂,提取的蛋白稳定。
● 紫外检测蛋白浓度时,背景干扰低。
● 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解,蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂;每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性。
试剂盒以外自备试剂和仪器:
● 离心机 ● 涡旋混匀器 ● 振荡器 ● 匀浆机/匀浆器 ● 100μm细胞筛
● PBS ● 蛋白定量试剂盒
使用注意事项:
● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
● 实验过程中的所有试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
● 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀,不影响使用,溶解后正常使用。
● 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
使用方法:
1、提取液制备:
每300μL冷的蛋白提取液B中加入2μL蛋白酶抑制剂;
每300μL冷的蛋白提取液C中加入2μL蛋白酶抑制剂,混匀后置冰上备用。
【注】:
● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液,蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完,再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
2、取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的200-500mg植物组织样本用手术剪刀尽可能剪碎,加入1-2mL提取液A后用匀浆机充分匀浆或者用Dounce匀浆器充分匀浆。
【注】:
● 匀浆尽可能充分,至无明显可见固体。
● 培养细胞直接收集细胞后用Dounce匀浆器匀浆即可,匀浆后加提取液A混匀后直接进行以下步骤离心。
● 处理叶片等组织样本如果没有匀浆机,也可先加少量提取液A后用Dounce匀浆器充分匀浆后再加提取液A混匀。
3、将匀浆液用100μm细胞筛过滤。
【注】:
● 没有细胞筛时可以不过滤,将匀浆液静置1分钟,待大的没有破碎的组织块自然沉降,吸取上清。
● 部分黏液较多的植物样本可能难以吸取,可以将1mL吸头的口剪掉一点再吸。
4、将滤液在1000×g条件下离心10分钟,收集上清(Ⅰ),收集沉淀(Ⅰ)。
5、在沉淀(Ⅰ)中加入200-300μL提取液B,充分混匀。
6、置振荡器振荡30分钟。
【注】:
● 用振荡器/摇床的较低转速,保持液体有轻微晃动即可。
● 没有低温振荡条件可以不振荡,在2-8℃静置,稍微延长处理时间,中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
7、在4℃,10000×g条件下离心10分钟。
8、将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到核蛋白。
9、将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
10、将上清(Ⅰ)在30000×g力条件下离心20分钟,弃上清,收集沉淀(Ⅱ)。
【注】:
● 实验室离心机达不到30000×g力时,使用离心机能达到的最大离心力,延长离心时间至30分钟。
11、在沉淀(Ⅱ)中加入200-300μL提取液C,充分混匀。
12、置振荡器振荡30分钟。
【注】:
● 用振荡器/摇床的较低转速,保持液体有轻微晃动即可。
● 没有低温振荡条件可以不振荡,在2-8℃静置,稍微延长处理时间,中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
13、在4℃,10000×g条件下离心10分钟。
14、将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到细胞器蛋白。
15、将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
【注】:
● 建议用BCA法进行蛋白定量。
● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题,注意不要被蛋白酶水解掉,不要被细菌污染。
常见分体分析:
● 蛋白浓度低?
植物核蛋白丰度较低,在条件允许的情况下,尽可能加大样本量。
处理部分样本时可能没有裂解完全,导致导致蛋白浓度低。只要适当增加试剂A的匀浆次数,并适当延长试剂B和C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理,没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀,至无明显沉淀。
● 用什么方法定量蛋白?
建议用BCA法。不适合用Bradford法,因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份,导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系,则可以用Bradford法定量。
● 提取时出现胶状沉淀?
蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下,可以直接离心取上清进行后续实验即可;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理,300w/10秒间隔10秒,超声3分钟,随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子,例如NF-kappaB、p53等时,不必进行超声处理。
● 提取的蛋白具有活性吗?
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份,不破坏蛋白的结构,没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏,蛋白均保持其天然构象和活性。
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