HR0958 细胞内pH值检测试剂盒

P01细胞内pH值荧光探针是可以穿透细胞膜的荧光染料，P01探针本身没有荧光，穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成荧光物质，从而被滞留在细胞内。产生的荧光物质最大激发波长为502nm，最大发射波长为 528nm，其在不同的pH值条件下发射的荧光强度不同，从而可以反映细胞内pH值得变化情况。...

试剂盒以外自备试剂和仪器：

● 激光共聚焦/流式细胞仪/荧光显微镜/荧光酶标仪或光度计 ● HBSS或HEPES或PBS(pH7.4)

注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。

● P01探针容易受潮，受潮后稳定性较差，注意干燥保存。

● 吸取P01探针母液时要用干燥的新吸头，不能使用含水的吸头。

● 未使用完的P01探针母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。

● P01探针工作液含水，配置后不可以长期保存，须现配现用。

● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

● 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞膜的通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。

● 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

● 染色后立即进行分析。

● 可以在染色溶液中加入等体积的20% Pluronic F127溶液，Pluronic F127帮助P01更快进入细胞，不建议在Pluronic F127中长期保存P01探针溶液。

使用方法：

1、染色工作液的配制：

根据样品数，用探针稀释液将P01探针10倍稀释， 然后再用HBSS缓冲液稀释P01探针溶液20～200倍，配制成P01探针染色工作液。

【注】：

● 推荐该探针加载浓度是试剂盒中探针母液的200～2000倍稀释，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。一般起始浓度用1000倍稀释即可。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。不同的细胞需要的浓度不同。我们在测试中最低用到过20000倍稀释使用仍然有良好的荧光信号。

● 也可以不用试剂盒提供的探针稀释液稀释探针，直接用HBSS缓冲液稀释，也可以用不含血清的培养基直接稀释探针。稀释后工作浓度是试剂盒中探针母液200-2000倍稀释。

● 不能用含血清的培养基稀释探针。

● 也可以用以下缓冲液稀释用于染色，直接将pH 探针加入，终浓度在200-2000 倍稀释即可。最佳的稀释液应能兼顾两方面——染料加载和良好的细胞反应。可能的选择有：Hank’s BSS 1×+ 20mM HEPES；Hank’s BSS 1× + 20mM HEPES + 1% BSA。

● 优化细胞种板的密度是很有必要的，保证了过夜培养后每孔可以形成密度相似的均一单细胞层。通过适当的调整种板时的密度，细胞可以培养超过一天来达到实验当天的要求。粘附性弱或生长不规则的细胞最好在用多聚赖氨酸、层黏蛋白或胶原蛋白包被过的多孔板中培养。

2、将P01探针染色工作液加入已处理好的细胞，在37℃孵育30-60分钟。

【注】：

● 最佳的孵育时间取决于细胞类型。由于荧光染料对细胞是有毒的，所以要严格控制孵育时间。45分钟、37℃是通常对大多数细胞都有效的孵育条件，一般也作为方法摸索时的起始推荐条件。如果孵育30分钟可以得到一个可接受的荧光信号，建议采用更短时间的孵育条件。

● 关于阴离子交换蛋白抑制剂：一些类型的细胞通过阴离子交换蛋白转移阴离子至细胞外，这些阴离子包含了P01荧光染料。这样不仅仅导致了染料加载效果的减弱，同时导致了最终数据结果的误差；丙磺舒是一种阴离子交换蛋白抑制剂，被加入到加载培养基中后可以增加染料保留在细胞内的比例。已知的一个需要丙磺舒的细胞类型是CHO。尽管丙磺舒可以延缓染料从细胞内被转移至胞外，但其对细胞来说有一定的毒性，因此染料加载后的孵育时间应尽可能控制在最短时间内。丙磺舒一般不需要使用，有条件则使用。

3、用PBS或HBSS洗涤细胞2-3次。用HBSS重悬细胞.

4、然后用该细胞进行荧光pH检测。激发波长 488～506nm，发射波长526～536nm。

【注】：

● 荧光强度增加则细胞内pH值增加，荧光强度降低则细胞内pH值下降。

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