HR8312 CFSE/7-AAD双染细胞毒性检测试剂盒

CFSE标记细胞呈绿色荧光，荧光波长：λex=496 nm,λem=516 nm。流式检测时的激发波长可以选择488nm，此时的发射波长为516nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。7-AAD 标记细胞呈红色荧光，流式检测时的激发波长可以选择488nm，此时的发射波长为650nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL3 detection channe...

检测方法：

● 荧光显微镜 ● 流式细胞仪 ● 激光共聚焦

样本类型：

● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器:

● 流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦 ● 离心机 ● CO₂培养箱 ● PBS或者HBSS（不含酚红）

使用注意事项：

● 旋帽离心管装试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

● 染色浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。

● CFSE母液极易水解，建议分装保存，分装后用封口膜密封管口，再用锡箔纸包裹，最后和干燥剂一起用塑料袋密封，≦-20℃冷冻保存。

● 冬天气温较低时CFSE溶解液会凝固，可先在37℃水浴至溶解液完全融解后再进行配制，配制过程中注意避免溶液凝固，保持温度至CFSE溶解完全。

● CFSE工作液应现配现用，不能提前配制，因为CFSE吸水会分解，影响染色效果。

● CFSE易被水解，在水溶液中会很快变质。母液请在使用过程中避免接触水。工作液在标记细胞的过程中和水接触是在许可的时间范围内的。

● CFSE标记细胞仅需5-15分钟即可完成。对于不同细胞，最佳标记时间需自行摸索。正式实验前，建议先做几个孔摸索染色浓度和加入CFSE试剂后的培养时间。

● 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

● 以下实验步骤仅供参考，请根据实际的实验方案设计或参考相关文献为准。

● 必须设置全阴，CFSE单标，7-AAD单标的靶细胞的参照以设置流式。

使用方法：

细胞CFSE染色：

1.根据需要检测的细胞样品数，用HBSS将CFSE母液200～4000倍稀释，配制成CFSE染色工作液。不同的细胞需要根据预实验结果确定最佳染色浓度。如果荧光强度弱，可以适当提高CFSE的终浓度。如果背景太高，可以适当降低CFSE的终浓度，请摸索条件找到最佳浓度。

【注】：

● 也可以用HBSS等缓冲液或相应的无血清培养基稀释染料母液至所需浓度。

● 开始实验前，使用HBSS缓冲液或培养基稀释CFSE到需要的工作浓度。工作浓度为根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，一般染色终浓度200～4000倍稀释。

● 一般起始浓度按500～1000倍稀释即可。

● 为了降低过度加载染料导致的潜在背景和细胞毒性，在不影响实验结果的前提下应尽可能低浓度染色。

● 工作液现配现用。

2.将培养好的待测靶细胞消化后收集，用PBS洗涤2次。

【注】：

● 400g离心5分钟。

3.将待测细胞用染色工作液重悬，至细胞浓度大约10⁷/ml。

4.在37℃培养箱中避光孵育15～30分钟。

5.加10倍体积的含血清培养基，400g离心5分钟。

6.离心后去上清，收集细胞，用HBSS或无血清培养基洗涤细胞1～2次，最后加入培养基重悬细胞。

7.在37℃培养箱中孵育20～30分钟。

细胞模型制备：

1.收集待检测的靶细胞。

2.进行相应的毒性药物处理或者效应细胞处理。

【注】：

● 效应细胞和靶细胞比例根据需要自行设定。常见比例如6.25：1；12.5：1；25：1等。

● 活的靶细胞成绿色；死的靶细胞成红色和绿色；死的效应细胞成红色，活的效应细胞成无色。

细胞检测：

1.收集制备好的毒性处理过的细胞模型。

2.用200μL HBSS重悬细胞，加入1μL 7-AAD染色液，混匀。

【注】：

● 微量的染色液注意有效的加入细胞悬液并充分混匀。

● 可以根据预实验确定的染色液浓度，直接用7-AAD和HBSS缓冲液配制成染色工作液，并用染色工作液重悬细胞。

3.在2～8℃避光孵育10～60分钟。

4.在400g离心5分钟收集细胞。

5.用500μL HBSS或PBS重悬细胞。

6.取500μL细胞悬液，用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

7.根据流式结果计算死亡细胞百分率。被杀伤死亡的靶细胞被7-AAD染上会出现在CFSE+7-AAD+区域，未杀伤的在CFSE+7-AAD-区域，得出被杀伤的靶细胞的比例。用这个比例再计算毒性。

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