HR8065 酵母膜蛋白/细胞质蛋白提取试剂盒

本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift 凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。...

产品特点：

● 使用方便。

● 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。

● 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

● 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

试剂盒以外自备试剂和仪器：

● 移液器 ● 离心机 ● 振荡器 ● 涡旋混匀器 ● PBS ● BCA蛋白定量试剂盒

使用注意事项：

● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

● 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。

● 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

使用方法：

1. 提取液制备：

每500μL酵母蛋白提取液B中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

每500μL膜蛋白溶解液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】：

● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。

● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

2. 取适量酵母培养物，在4℃，2000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。

3. 用冷PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

4. 每100-200μL体积酵母沉淀物中加入500μL酵母蛋白提取液A，混匀后，在室温或37℃条件下轻轻振荡30分钟-1小时。

【注】：

● 若后面步骤中试剂B 处理时沉淀难以裂解，应延长此步试剂A 的处理时间。

● 有些酵母样本细胞壁较厚，难以破壁，最长可以将试剂A 处理时间延长至8 小时。

5. 在4℃，2000×g条件下离心5-10分钟，移除上清，收集沉淀。

6. 在沉淀物中加入500μL冷的（4℃）酵母蛋白提取液B，混匀。

7. 在2-8℃条件下轻轻振荡15-45分钟。

【注】：

● 必须在2-8℃条件下处理。

● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。

● 没有2-8℃振荡条件也可不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。

● 试剂B 处理后沉淀应明显减少，否则延长处理时间。

● 若延长时间后沉淀仍难以裂解，应延长试剂A的处理时间。

8. 将提取液在4℃条件下12000×g离心5分钟，取上清。

【注】：

● 此时酵母膜蛋白已溶解于抽提液B，酵母菌体沉淀会减少，若有大量未溶解酵母菌体，请延长步骤4和步骤7的振荡时间，振荡中途可用移液器吹打混匀。

9. 将上清在37℃水浴10分钟。

10. 在37℃ 1000×g离心3分钟。

【注】：

● 此步骤必须在37℃离心。

● 无37℃条件离心也可不离心，延长37℃水浴时间至液体澄清，分层明显即可。

11. 此时溶液分为2层，上层部分为酵母细胞质蛋白，下层为膜蛋白。

12. 小心移除上层胞质蛋白部分，留下管底部下层部分大约30-50μL液体。

13. 用50-100μL膜蛋白溶解液C溶解该下层溶液，即得酵母膜蛋白样品。

14. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

【注】：

● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。

● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

常见问题分析：

● 蛋白浓度低？

膜蛋白丰度较低，需要加大细胞上样量。处理部分细胞样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A和B的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

● 用什么方法定量蛋白？

建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

● 提取的蛋白具有活性吗？

本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

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