HR0095 细菌外膜蛋白提取试剂盒

本试剂盒提取的蛋白可用于WB、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。...

产品特点：

1、使用方便。

2、含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。

3、紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

4、蛋白酶抑制剂抑制了蛋白降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化组成使其可抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

5、本品不含EDTA，可以用于金属螯合层析等下游应用。

试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：

● 离心机 ● 振荡器 ● 涡旋混匀器 ● 移液器 ● PBS ● 蛋白定量试剂盒

使用注意事项：

● 旋帽离心管装试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

● 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。

● 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

使用方法：

1、提取液准备：

每500μL提取液A 中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。

【注】：

● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。

● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

2、收集待提取菌体，用PBS洗菌体2次。

3、按每50-150mg湿重菌体样本加入500μL提取液A（大约菌体和提取液体积比1:2-1:5，完全淹没菌体即可），吹打混匀，在2-8℃振荡30分钟-1小时。

【注】：

● 此步骤必须在2-8℃条件下振荡，不可室温处理。

● 裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。

● 细菌外膜蛋白丰度极低，需要保证足够的菌体上样量才能提到足够蛋白，在条件允许的情况下，请尽可能加大菌体上样量。

● 如果没有2-8℃振荡条件，可以在2-8℃静置，稍微延长试剂A处理时间，中间每隔10分钟用移液器吹打混匀。

4、将提取液在2-8℃下12000g力离心5分钟，取上清。

5、将上清液在37℃水浴10分钟。

6、在37℃ 500-1000g力离心3 分钟。

【注】：

● 此步骤必须37℃条件下离心。

● 如果离心机不可控温，可以不离心，延长上一步骤水浴时间，至溶液分层清晰即可。或者在室温条件下离心，缩短离心时间至1分钟。

7、此时液体分为2层，小心移除上层溶液，留管底部下层大约30-50μL液体。

【注】：

● 下层为粘稠状液体。

8、用50-150μL 冷的膜蛋白溶解液溶解该溶液，即得细菌外膜蛋白样品。

9、将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

【注】：

● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。

● 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

● 可以用溶解液C或者其他合适缓冲液如PBS调整蛋白浓度。

常见问题分析：

● 蛋白浓度低？

膜蛋白丰度较低，需要尽可能加大细胞上样量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。也可以用蛋白浓缩柱进行浓缩处理（相关产品HR0388）。

● 用什么方法定量蛋白？

建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

● 提取的蛋白具有活性吗？

本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

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