HR0863 活性氧(ROS)检测试剂盒-DCFHDA法

在激发波长502 nm，发射波长530 nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测DCF 荧光，从而测定细胞内活性氧水平。本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧的检测。...

产品特点：

● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；

● 背景低，灵敏度高；

● 线性范围宽，使用方便。

检测方法：

● 流式细胞仪 ● 荧光显微镜 ● 激光共聚焦

样本类型：

● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器

● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，激发波长500±15nm，发射波长±20nm，或者按照FITC荧光检测条件检测。

● PBS ● HBSS(无酚红) ● 移液器 ● 离心机

使用注意事项：

● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

● 荧光探针标记后，一定要洗净残余未进入细胞内的探针，否则导致背景较高。

● 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。

● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

● 对于药物作用时间较短(2小时以内)的细胞，先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时间较长(6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照诱导剂或相应的药物刺激细胞，后标记探针。

● 阳性对照诱导剂为选用试剂，并非必须使用。可以按照1:1000的比例使用。例如标记好探针的细胞共1mL，可以加入1μL的阳性对照诱导剂刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照诱导剂的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照诱导剂的浓度。

● 对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:10000稀释DCFH-DA。探针标记的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。

使用方法：

一、探针标记：

原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。

1、按照1:1000-2000用无血清培养液稀释DCFH-DA。

【注】：

● 不能用含有血清的培养基稀释DCFHDA探针。

● 也可以用HBSS缓冲液稀释探针。

2、去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。

3、加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于96孔板每孔加入100-200μL染色液，对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA 不少于1mL。
4、在37℃细胞培养箱内避光孵育20-60分钟。

5、用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

【注】：

● 也可以用HBSS/PBS洗涤细胞。

● 前期细胞样本准备时仅在阳性对照孔加入阳性对照诱导剂，其余孔不必加入。

● 通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

● 阳性诱导剂根据需要使用，并非必须。如果实验细胞模型已经制备有阳性对照细胞，也可以不使用。

收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理

1、按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DA。

【注】：

● 不能用含有血清的培养基稀释DCFHDA探针。

● 也可以用HBSS缓冲液稀释探针。

2、离心移除培养基，用PBS洗细胞一次。

3、细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为1×10⁶-2×10⁷/毫升，37℃细胞培养箱内避光孵育20-60分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

4、用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

5、用无血清细胞培养基重悬细胞。

【注】：

● 也可以用HBSS/PBS洗涤细胞。

● 前期细胞样本准备时仅在阳性对照孔加入阳性对照诱导剂，其余孔不必加入。

● 通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

● 阳性诱导剂根据需要使用，并非必须使用。如果实验细胞模型已经制备有阳性对照细胞，也可以不使用。

二、检测：

对于原位标记探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。

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