HR8046-50T 植物核蛋白提取试剂盒(酶法，pull down适用)

本试剂盒提供全套试剂，适用于从各种植物细胞和各种实体植物组织，如叶片、根、种子等植物组织中提取核蛋白。提取过程简单方便。制备的核蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解植物核组份。含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保...

产品特点：

1、使用方便。

2、含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。

3、紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

4、蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含5种独立的蛋白酶抑制剂Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：

● 离心机 ● 振荡器 ● 涡旋混匀器 ● Dounce匀浆器/匀浆机

● PBS ● 蛋白定量试剂盒

使用注意事项：

● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

● 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。

● 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

使用方法：

1、提取液制备：

每200μL提取液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】：

● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。

● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

2、取洗净擦干并去除叶梗和粗脉的200-500mg植物组织样本用手术剪刀尽可能剪碎，加入1-2mL PBS后用匀浆机充分匀浆或者加适量PBS后用Dounce匀浆器充分匀浆。

3、将匀浆液用100μm细胞筛过滤；

【注】：

● 没有细胞筛的话，在4℃，稍微静置，让粗纤维，成团组织块等沉降，或者以低于100×g力条件下离心1分钟，收集细胞上清，弃组织沉淀。

● 有些含黏液较多的样品可能难以吸取，可以将1mL 吸头尖稍微剪掉一点使用。

4、将滤液在2000×g条件下离心5-10分钟，收集沉淀。

5、在沉淀中加入500μL提取液A，充分混匀。

【注】：

● 培养细胞1000×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞后用PBS洗涤2次，然后直接加入提取液A 重悬。

● 大约每300μL细胞压积中加入1mL 提取液A。

● 一般加入样本体积的2-3倍体积的提取液A，充分淹没样本即可。

6、将细胞悬液置振荡器上37℃或室温振荡12-72小时。

【注】：

● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。

● 没有振荡条件也可以不振荡，中间每隔几小时用移液器吹打混匀即可。

● 根据下游蛋白的应用选择合适的温度，最佳温度为55℃。

● 不同类型的植物样本需要处理的时间差异较大。拟南芥较易处理，鲜嫩叶片较易处理，年龄小的样本处理时间短。拟南芥嫩叶最短4 小时即可。

● 部分细胞壁较厚的植物类型可能需要处理更长时间。可以延长至72小时以上处理以提高核蛋白得率。

7、在2000×g条件下离心10分钟，弃上清，收集沉淀。

8、在沉淀中加入500μL-1mL提取液B，用Dounce匀浆器充分匀浆，在匀浆液中补充提取液B至1mL，充分混匀。

9、置振荡器振荡5-10分钟。

【注】：

● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。

● 没有振荡条件也可以不振荡，置4℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。

10、在2000×g条件下离心10分钟，弃上清，收集沉淀。

11、在沉淀中加入100-200μL冷的提取液C，高速涡旋振荡5秒。

12、置4℃振荡20-40分钟。

【注】：

● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。

● 没有振荡条件也可以不振荡，置4℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。

13、在4℃，12000×g条件下离心10分钟。

14、将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。

15、将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

【注】：

● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。

● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

常见问题分析：

● 蛋白浓度低？

植物核蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，尽可能增加样本量。

处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当增加试剂A的匀浆次数，并适当延长试剂A和B的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

● 用什么方法定量蛋白？

建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

● 提取时出现胶状沉淀？

蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，不必进行超声处理。

● 提取的蛋白具有活性吗？

本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

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