HR0416-50T Rho123细胞膜电位检测试剂盒

线粒体膜电位检测试剂盒(RHO123)是利用Rhodamine 123探针检测线粒体膜电位变化的试剂盒，可以快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，可以用于早期的细胞凋亡检测。...

检测方法：

● 流式细胞仪 ● 荧光显微镜 ● 激光共聚焦

样本类型：

● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器：

● 流式细胞仪/激光共聚焦/荧光显微镜 ● PBS或HBSS(无酚红) ● 离心机

注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

● 始终保持平衡染液中pH 值的一致性，因为pH 值的变化将影响膜电位。

● 根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。

● 线粒体膜电位降低，荧光强度减弱。但是结果分析时注意排除荧光淬灭现象，Rho123荧光物质的激发光谱和发射光谱有一部分是重合的，其发射光有一部分(与激发光重合的部分)会被自己重新吸收，而且这种吸收的效益随着该荧光物质的浓度增加而增强。换而言之，当荧光物质浓度很高的时候其荧光强度和浓度的增加不成正比，此时注意检测结果的分析。采用JC-1法可以减少荧光淬灭的影响。

使用方法：

悬浮细胞：

1、试剂配制：

1×染色缓冲液配制：

根据样品数按下列比例配制1×染色缓冲液，取100μL 10×染色缓冲液加900μL纯水稀释，混匀并预热至37℃，即成1×染色缓冲液；

Rho123染色工作液的配制：

根据样品数按下列比例配制Rho123染色工作液。在500μL 1×缓冲液中加入4μL Rho123，混匀配成Rho123 染色工作液。

2、收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。

3、用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞。

【注】：

● 300×g -500×g，2-8℃，离心时间5分钟收集细胞。

4、用500μL Rho123染色工作液将细胞重悬，细胞密度约5-10×10⁵个/ml。37℃，5% CO₂的培养箱中孵育15分钟。

5、常温离心收集细胞。 用PBS 洗涤细胞1 次。

【注】：

● 300×g -500×g，离心时间5分钟收集细胞。

6、用500μL预热的1×染色缓冲液将细胞重悬。

7、用流式细胞仪或荧光酶标仪/分光光度计检测分析结果，或用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。

贴壁细胞：

对于贴壁细胞，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

纯化线粒体：

1、把配制好的RHO123染色工作液再用RHO123孵育缓冲液(1×)稀释5倍。

2、0.9mL 5倍稀释的RHO123染色工作液中加入0.1mL总蛋白量为10～100μg的纯化的线粒体。

3、结果检测。

组织样本：

组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。

结果分析：

检测时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm。

线粒体膜电位降低，荧光强度减弱。

用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的情况。

也可用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察；用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测。

常见问题分析：

● 出现凋亡细胞荧光强度高于正常对照细胞的情况？

Rho123染色检测线粒体膜电位时，理论上一般正常情况均是随着细胞凋亡，线粒体膜电位降低，荧光强度减弱。但是Rho123染料的特性决定不同的细胞类型、染色方式、染液浓度、染色与处理的顺序等因素都可以明显影响Rho123的染色结果。其中影响最显著的是细胞ΔΨm(Rho123的总摄入)、细胞质膜的Pgp(P-糖蛋白)/MRP(多药耐药相关蛋白)(Rho123的胞内保留)和Rho123的self-quenching等3个因素。

当某些模型中质膜Pgp 外排的影响或者线粒体中Rho123浓度很高导致的荧光self-quenching的影响超过了MMP 降低的影响时，会出现凋亡细胞(膜电位降低细胞)的荧光强于对照细胞的现象，但此时胞内的Rho123主要分布于胞浆中，而不是线粒体内。

还有一些比较少见的情况是，有些模型的ΔΨm在细胞凋亡早期会有一过性升高，Rho123染色会一过性增强，如果检测的时间点恰好重合，也会出现凋亡细胞荧光强度高于正常对照细胞的现象。

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