HR8205 外泌体提取试剂盒(血清/血浆)

本试剂盒按每个样本处理2mL血清/血浆计,每个50T试剂盒大约可以用于提取100mL血清/血浆。如果需要处理大量的血清/血浆,将提取液按说明书标准操作的体积等比例调整即可。...

产品特点：

● 使用方便,无需超速离心,省时省力；

● 纯度高,富集量大,应用范围广；

● 获取的Exosome结构和功能完整；

● 稳定性好,便于运输,便于保存。

使用注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装试剂开盖前请短暂离心,避免开盖时试剂损失。

● 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂。

● 以下以2mL血清/血浆为例,实际操作时按血清样本和提取液用量体积比等比例调整使用即可。

● 不同血清/血浆样本外泌体数量差异极大,请根据实际情况选择血清/血浆样本量,根据下游应用和参考文献确定。条件允许情况下采用尽可能多的样本。

● 常规的血清/血浆样本最佳培养上清上样量为5-10mL及以上,条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆样本。

● 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察,只能冰上或4℃保存,存放时间不超过两天,注意不可冷冻保存,否则可能会影响电镜观察效果。

操作步骤：

1、收集2mL待提取的血清/血浆样品,置2-8℃保存。

【注】：

● 冻存样品解冻后置2-8℃保存。

2、将样品在4℃条件下,3000×g离心15分钟。弃沉淀,收集上清。

3、小心将上清移入另一干净离心管中。

4、将样品在4℃条件下,10000×g离心20分钟。弃沉淀,收集上清。

5、小心将上清移入另一干净离心管中。

6、在2mL血清/血浆样品中加入2mL提取液A,盖紧离心管盖,上下颠倒混匀1分钟左右,使液体充分混匀。

7、在4mL液体样品中加入1mL提取液B,盖紧离心管盖,上下颠倒混匀1分钟左右,使液体充分混匀。

【注】：

● 试剂B使用前请充分混匀。

8、置2-8℃冰箱静置过夜。

【注】：

● 静置保存时间不少于10小时。

9、在4℃条件下,10000×g离心60分钟。

10、小心移除上清,收集沉淀。

【注】：

● 尽可能吸干上清。

● 吸取时小心,防止吸掉沉淀。

11、取50-100μL外泌体保存液将沉淀重悬,即得到外泌体样品。

【注】：

● 可以不用试剂盒中的外泌体保存液试剂C,根据下游实验需要用自己的其它缓冲液重悬保存外泌体。

● 也可直接用于蛋白提取。

● 血浆和血清样本的外泌体提取会得到较多的胶状沉淀，可以延长移液器吹打混匀时间或者涡旋振荡时间至完全溶解为止。

● 胶状沉淀难溶解可以适当增加保存液的用量。

12、将外泌体样本-80℃保存或直接用于下游应用。

【注】：

● 外泌体短期保存置于2-8℃保存即可,一周以上长期不用时置-80℃保存。

● 保存前可以用0.22μm过滤除菌。

常见问题分析：

● 采用血浆(plasma)还是血清(serum)来源的外泌体？

对于大多数涉及到Exosome RNA分离的研究,我们推荐使用血浆(plasma)。因为血清收集后在凝血过程中,血小板受到刺激会产生许多Exosome和其他形式的小泡,因此血清中获得的小泡始终比血浆中多,甚至超过50%小泡来源于血小板。所以血浆是研究病理生理状态下Exosome更好的介质。多数的criculating Exosome研究样本使用的是血浆。负压采血之后,血液首先存放入采血管,去除止血带,最初的几毫升不要,因为有压力激活效应,并且被成纤维细胞污染。血液收集应该轻柔并且迅速。颠倒混匀采血管8-10次,与管壁上的抗凝剂混合,但不要为了抗凝而剧烈摇动。离心前管子应该垂直存放,并记录实验室中存放的时间,因为从采血到离心除去细胞和血小板这中间的过程很重要,建议在30min内完成,长时间存放,而没有及时处理会导致血小板细胞Exosome的进一步释放。血液要尽快处理,在室温条件下分离血浆(或者血清)。所有样品要使用相同的转速和转子类型离心。

● 怎样选择抗凝剂？

抗凝剂有一个或多个形式的功能,包括螯合钙、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。一般选用EDTA 抗凝。其它有许多抗凝血剂可用,但不建议使用肝素抗凝剂。无论是外源性或内源性起源(例如肥大细胞),肝素会抑制下游PCR反应,因为肝素会与引物和酶竞争与核酸结合。另外,肝素可抑制Exosome与靶细胞的结合,抑制Exosome激活血小板或降低血小板激活阈值。应用肝素治疗的病人也应该注意。对于珍贵样本,可能需要从肝素化的血液样品中提取RNA。核酸的检测需要通过调整PCR的敏感性。另外如果Exosome相关核酸被发现只存在于Exosome内,在RNA分离之前的洗涤也可以帮助去除肝素。其它抗凝剂如EDTA、氟化钠/草酸钾, 或柠檬酸三钠[加入/不加右旋糖或茶碱、腺苷和双嘧达莫]就更复杂了,最好根据下游的试验来指导。CTAD阻碍血小板活化和随后的Exosome释放。EDTA可干扰PCR反应(尽管程度低于肝素),但它的存在可能是无害的。另外,下游实验的选择需要考虑到抗凝剂的使用种类。不同的聚合酶对抑制剂有不同的敏感性。

● 采血管的选择方法？

血浆采用紫盖采血管(EDTA-K2或EDTA-K3),例如BD货号：367841-2mL

367862-4mL 367863-6mL 366643-10mL等；血清采用黄盖采血管(促凝管或促凝

管带分离胶),例如BD货号：366566-5mL 367985-10mL等。

● 如何鉴定提取的外泌体？

通常使用透射电镜检测(形态)、粒径检测(大小)、外泌体标志蛋白Western blot

检测等方法鉴定提取的外泌体。

● 外泌体WB标志蛋白用什么？

在进行WB检测时,通常检测外泌体标志蛋白为CD63、CD9、CD81、TSG101、ALIX、HSP70等。

● 进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？

没有,该检测属于定性检测。

● 蛋白浓度低？

很多细胞外泌体量不够下游应用,在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。处理部分样本时可能没有裂解完全,导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。

● 抽提得到的RNA浓度低？

很多细胞外泌体量不够下游应用,条件允许情况请尽可能加大培养上清上样量。

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