HR8312-500T CFSE/7-AAD双染细胞毒性检测试剂盒
CFSE/7-AAD双染细胞毒性检测试剂盒是利用细胞荧光染料CFSE(CFDA-SE)和7-AAD对细胞进行染色,利用CFSE标记靶细胞,7-AAD标记死的靶细胞来区分不同的细胞,活的靶细胞成绿色,死的靶细胞成红色和绿色,从而检测细胞毒性作用。根据不同的实验方案设计,可以用来检测化合物的细胞毒性作用。也可以用来检测杀伤性T 细胞或NK 细胞...
检测方法:
● 荧光显微镜 ● 流式细胞仪 ● 激光共聚焦
样本类型:
● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞
试剂盒以外自备试剂和仪器:
● 流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦 ● 离心机 ● CO2培养箱 ● PBS或者HBSS(不含酚红) ● 荧光专用黑色96孔板
使用方法:
细胞CFSE染色:
1.根据需要检测的细胞样品数,用HBSS将CFSE母液200~4000倍稀释,配制成CFSE染色工作液。不同的细胞需要根据预实验结果确定最佳染色浓度。如果荧光强度弱,可以适当提高CFSE的终浓度。如果背景太高,可以适当降低CFSE的终浓度,请摸索条件找到最佳浓度。
【注】:
● 也可以用HBSS等缓冲液或相应的无血清培养基稀释染料母液至所需浓度。
● 开始实验前,使用HBSS缓冲液或培养基稀释CFSE到需要的工作浓度。工作浓度为根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度,一般染色终浓度200~4000倍稀释。
● 一般起始浓度按500~1000倍稀释即可。
● 为了降低过度加载染料导致的潜在背景和细胞毒性,在不影响实验结果的前提下应尽可能低浓度染色。
● 工作液现配现用。
2.将培养好的待测靶细胞消化后收集,用PBS洗涤2次。
【注】:
● 400×g离心5分钟。
3.将待测细胞用染色工作液重悬,至细胞浓度大约107/ml。
4.在37℃培养箱中避光孵育15~30分钟。
5.加10倍体积的含血清培养基,400×g离心5分钟。
6.离心后去上清,收集细胞,用HBSS或无血清培养基洗涤细胞1~2次,最后加入培养基重悬细胞。
7.在37℃培养箱中孵育20~30分钟。
细胞模型制备:
1.收集待检测的靶细胞。
2.进行相应的毒性药物处理或者效应细胞处理。
【注】:
● 效应细胞和靶细胞比例根据需要自行设定。常见比例如6.25:1;12.5:1;25:1等。
● 活的靶细胞成绿色;死的靶细胞成红色和绿色;死的效应细胞成红色,活的效应细胞成无色。
细胞检测:
1.收集制备好的毒性处理过的细胞模型。
2.用200μL HBSS重悬细胞,加入1μL 7-AAD染色液,混匀。
【注】:
● 微量的染色液注意有效的加入细胞悬液并充分混匀。
● 可以根据预实验确定的染色液浓度,直接用7-AAD和HBSS缓冲液配制成染色工作液,并用染色工作液重悬细胞。
3.在2~8℃避光孵育10~60分钟。
4.在400×g离心5分钟收集细胞。
5.用500μL HBSS或PBS重悬细胞。
6.取500μL细胞悬液,用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
7.根据流式结果计算死亡细胞百分率。被杀伤死亡的靶细胞被7-AAD染上会出现在CFSE+7-AAD+区域,未杀伤的在CFSE+7-AAD-区域,得出被杀伤的靶细胞的比例。用这个比例再计算毒性。
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