HR8787-100T 单线态氧检测试剂盒

单线态氧检测试剂盒是利用单线态氧特异性荧光探针单线态氧探针O22检测单线态氧的试剂盒。单线态氧探针O22是合成的苯蒽类荧光探针,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,与细胞内单线态氧反应,被氧化生成绿色荧光物质,绿色荧光强度与细胞内单线态氧水平成正比,检测绿色荧光就可以知道细胞内单线态氧的变化情况。...

产品特点：

● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；

● 背景低,灵敏度高；

● 线性范围宽,使用方便。

试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：

● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪,激发波长500±10nm,发射波长530±10nm,或者按照FITC荧光检测条件检测。

● 离心机 ● 移液器 ● PBS缓冲液(pH7.4,1×)● HBSS(含钙镁,不含酚红)

使用注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体收集至管底,避免开盖时液体洒落。

● 荧光探针标记后,一定要洗净残余未进入细胞内的探针,否则导致背景较高。

● 探针标记完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的标记情况是否正常。

● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。

● 单线态氧O22在光照和空气中易被氧化,注意避光密封保存。

● O22染色工作液必须现配现用,并且在当天用完。

● O22对湿度非常敏感,若是O22溶液每次取完需要量后,必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量,分装密封保存。不可使用含水的吸头。

● 对不同的细胞和组织,应选择合适的孵育时间和浓度,以观察单线态氧的变化,很多细胞内的单线态氧绝对水平较低,需要根据实际情况适当延长孵育时间。

● 单线态氧O22探针可以根据需要的用量分装后冻存,避免反复冻融。

● 单线态氧O22不可一次性全稀释后长期保存,稀释后稳定性变差,有效期缩短。

● 单线态氧含量高则细胞荧光强度强。

● 以下操作步骤仅供参考，请根据实际样本情况调整或参考文献。可以用荧光酶标仪、共聚焦/显微镜等原位检测，也可以收集后染色用流式细胞仪等检测。

使用方法：

单线态氧探针O22配制：

根据样本数量计算需要的用量,用探针稀释液5倍稀释单线态氧O22探针后充分混匀,避光保存备用。 稀释后的单线态氧O22荧光探针最好在一个月内用完,尽量避免反复冻融。

【注】：

● 可以不用试剂盒的稀释液,直接用HBSS或不含血清的培养基稀释。

● 不可以一次性将探针全部稀释。

● 也可以不稀释探针，直接在待检测样本中加入0.5-1μL探针（100μL体系），但是需要用好的移液器和吸头，注意操作过程，保证探针有效的加入了样品中，并充分混匀。

● 现配现用。

● 没用完的稀释后的单线态氧O22荧光探针保存在4℃冰箱，最好在一周内用完，尽量避免反复冻融。

单线态氧O22探针标记：

单线态氧O22溶液可在新鲜无血清培养基、HBSS缓冲盐溶液或组织灌流液中稀释到所需浓度,终浓度按试剂盒的母液的100-200倍稀释,以此染色液更换细胞培养液或灌流液；也可直接向无血清细胞孵育液体或灌流液中加入单线态氧O22探针溶液至所需浓度。

原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。

1、按照1:100-200用无血清培养基稀释单线态氧O22探针。

【注】：

● 不能用含有血清的培养基稀释O22探针。

● 也可以用HBSS或PBS缓冲液稀释探针。

● 如果是前面已经5倍稀释过的探针，此步再次进行20-40倍稀释，或者直接一次性100-200倍稀释。

2、去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。

【注】：

● 加入PBS再吸出。

3、加入适当体积稀释好的O22探针。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于96孔板每孔加入100-200μL染色液，6孔板一个孔加入稀释好的O22探针不少于1mL。

4、在37℃细胞培养箱内避光孵育20-60分钟。

【注】：

● 若染色不够充分，延长染色时间。

● 依据细胞单线态氧含量的不同，单线态氧O22探针终浓度可以选择在100-200倍稀释的范围，孵育时间可以选择20分钟-4小时，通常30分钟左右即可。在37℃或室温进行避光孵育。

5、用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O22探针。

【注】：

● 也可以用HBSS/PBS洗涤细胞。

● 漂洗时间要短。

6、荧光酶标仪/共聚焦/显微镜检测。

收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理

1、按照1:100-200用无血清培养基稀释单线态氧O22探针。

【注】：

● 不能用含有血清的培养基稀释O22探针。

● 也可以用HBSS或PBS缓冲液稀释探针。

● 如果是前面已经5倍稀释过的探针，此步再次进行20-40倍稀释，或者直接一次性100-200倍稀释。

2、离心移除培养基，用PBS洗细胞一次。

【注】：

● 500×离心5分钟。

3、细胞收集后悬浮于稀释好的O22探针中，细胞浓度为1×10⁶-2×10⁷/mL，37℃细胞培养箱内避光孵育20-60分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

【注】：

● 若染色不够充分，延长染色时间。

4、用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O22探针。

5、用无血清细胞培养基重悬细胞。

【注】：

● 也可以用HBSS或PBS洗涤细胞。

6、流式细胞仪/显微镜检测。

荧光显微镜观察：

1、对贴壁生长细胞或活组织,可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞,取25-50μL细胞悬液滴到一张显微载玻片上,再盖上一张盖玻片。

2、荧光显微镜下观察。

激发波长488nm，发射波长526nm。

【注】：

● 单线态氧含量高则细胞荧光强度强。

流式细胞仪分析：

1、对贴壁生长细胞,用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞,直接收集细胞。染色并洗涤后用用0.5～1mL冰冷PBS重悬细胞(5～10万)。

2、采用488nm波长激发,测定待测细胞平均荧光强度。

使用488nm激发波长,525nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱变化情况。

【注】：

● 单线态氧含量高则细胞荧光强度强。

● 探针O22荧光光谱和FITC非常相似,可以用FITC的参数设置检测探针O22产物。

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