HR8599-100T TRITC-Phalloidin染色试剂盒

细胞骨架染色试剂盒采用丝状肌动蛋白F-actin荧光染色法染色细胞骨架，可以用于各种动物、植物的细胞骨架染色。本试剂盒采用荧光探针TRITC(Rhodamine，罗丹明，Tetramethylrhodamine Isothiocyanate)标记的鬼笔环肽(Phalloidin)来标记骨架蛋白F-actin。TRITC为橙红色荧光探针。...

试剂盒以外自备试剂和仪器：

● 荧光显微镜/激光共聚焦 ● PBS缓冲液 ● 固定液4%多聚甲醛 ● 透化液0.05-0.1% Triton X-100(溶于PBS) ● 100 nM DAPI溶液 ● 盖玻片周围密封液(如透明指甲油) ● 纯水 ● 载玻片和盖玻片

使用注意事项：

● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失。

● 标本应新鲜，且未受其他化学物品污染。

● 应根据组织、细胞类型不同调整通透时间。

● 动物细胞样本细胞通透剂处理的时间很关键，如果处理时间太短，会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架的观察；如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维断裂，造成细胞空洞。通透时间应控制在10-35分钟。需要根据预实验的染色结果确定最佳通透时间。一般预实验起始通透时间植物样本为10分钟，动物细胞样本5分钟。

● 染色液染色时间根据预实验结果可以进行调整，颜色过浅可延长染色时间，颜色过深可缩短染色时间。

● 洗片时动作要轻柔，避免将细胞从玻片上洗掉。

● 染色后用水充分洗涤，自然晾干即可，不能用常规的酒精梯度脱水方法。

● 不同样本的操作方法稍有差异，请根据具体样本操作。

● 下面以细胞爬片/涂片样本的染色为例，滴加相应的试剂到玻片上，加样量以覆盖样本即可。如果是植物切片等，也可以在离心管、试管等里面进行洗涤、通透、染色等操作，最后置载玻片上观察即可。

使用方法：

1. 染色工作液配制：

根据样本数量，用染料稀释液将TRITC-Phalloidin荧光染料10倍稀释。

再用相应的无血清培养基或其他缓冲液(如HBSS、PBS等)将荧光染料进行10倍稀释，配制成染色工作液。

【注】：

● 也可以不使用本试剂盒中的试剂B，直接用相应的培养基或HBSS等缓冲液稀释染料至所需浓度。

● 开始实验前，使用培养基或HBSS缓冲液稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，建议至少在超过10 倍范围的浓度下进行测试。一般染色终浓度50-150 倍稀释，100倍适合大多数细胞样本。

● 工作浓度为根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度。起始测试工作浓度可以用100倍稀释。

● 工作液现配现用。

● 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。

2. 将制作好的细胞爬片/细胞涂片用37℃预热的1×PBS(pH 7.4)清洗2次。

3. 细胞固定：滴加溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定5-10分钟，立即用PBS洗涤3-5次。

【注】：

● 避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。

● 样本多时可用容器装好PBS分别浸泡洗涤3-5次，样本较少时也可以加500μL PBS到玻片上进行洗涤。

● 此步骤为动物细胞样本的步骤，植物切片类不需要做此步骤，第2步洗涤完直接进行第4步通透即可。

4. 室温条件下，透化细胞：滴加0.05-0.1% Triton X-100/PBS溶液透化处理样本，处理3-5分钟。

【注】：

● 经Triton破膜过度后，TRITC-Phalloidin可能对细胞核有非特异性染色，注意通透时间。

● 该步骤可以省略，因为TRITC-Phalloidin分子量比较小，多聚甲醛固定后细胞膜产生的部分孔洞可以让TRITC-Phalloidin进入细胞。

5. 室温条件下，用PBS洗细胞3-5次，自然晾干。

6. 室温条件下，染色：用适量细胞骨架染色液工作液，覆盖住玻片上的细胞，室温避光孵育40分钟-更长时间，最长可以过夜染色，一般40分钟-1小时即可。

【注】：

● 可以在染色工作液内加入终浓度为1% BSA，能起到降低背景的作用；

● 或者在染色前用含1% BSA的PBS液室温封闭细胞20-30分钟。

● 孵育过程中为了避免溶液挥发，可将玻片转移到一个密封的容器内。

7. 用PBS洗细胞3次，每次5分钟。自然晾干。

8. 使用适量浓度为100nM的DAPI溶液对细胞核进行复染，约30 秒即可。

【注】：

● 此步骤为选做步骤，可以不进行核复染。

● 也可以根据需要选择其它颜色的核染料。

9. 用PBS洗细胞。

10. 用激光共聚焦显微镜观察。TRITC-Phalloidin激发/发射波长540-545/565-595nm和DAPI激发/发射波长359-364/454-461nm。

【注】：

● 或封片后观察。

● 标本玻片可置于4℃避光保存，通常6个月内可继续做染色分析。

染色结果：

细胞骨架纤维呈橙红色。细胞核呈蓝色(如果DAPI复染)。

细胞核和细胞质表面分布许多排列不规则的纤维束，走向清晰。

【注】：

● 如果见到部分细胞骨架纤维并非呈纤维状，而是呈串珠状或颗粒状，可以进一步优化通透、染色时间、染液浓度等条件。

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