HR0482-250T CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒

本产品是应用新型的水溶性四唑盐2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐快速高灵敏度检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测产品。...

产品特点：

● 使用方便：仅使用单一试剂；

● 灵敏度高，数据可靠，重现性好，线性范围更宽；

● 结果稳定：试剂本身稳定性高，实验结果稳定可靠；

● 无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低；

● 适合于高通量药物筛选。

试剂盒以外自备试剂和仪器：

● 带有450nm滤光片的酶标仪 ● CO₂培养箱 ● 96孔培养板 ● PBS ● 纯水 ● 移液器

注意事项：

● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

● 正式实验前，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。在之间摸细胞数量。培养时间一般在1-4小时。

● 部分药物可能对检测有影响，有影响时需换液后检测，无影响时直接检测。用培养基或PBS来配制待检测药物，加入CCK-8试剂，测药物溶液在450nm处的吸光度。如果该吸光度与不含药物仅加CCK-8试剂的培养基或PBS吸光度差异不大，则可以直接加入CCK-8，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100μL培养基和10μL CCK-8进行检测。

● 如果样品为高浑浊度的细胞悬液，或者为了去除其他颜色物质的影响，建议设定600nm(或600nm以上)作为参比波长，以OD450扣除参比波长的OD值即可。

● 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基，而不作为指标检测孔。

● 培养时间据细胞种类不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况下，白细胞较难染色，因此需要较长的培养时间或增加细胞数量(～10⁵个细胞/孔)。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对千悬浮细胞，在培养1-4小时后，可先从培养箱中取出，目察染色程度或用酶标仪测定决定。若染色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确定。染色的最佳时间可定为悬浮细胞的最佳培养时间。对于贴壁细胞，培养时间一般为1-4小时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察染色程度(根据细胞种类而定，需要摸索一下条件)。当时用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔(100μL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500个/孔(100μL培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

● 有条件的悄况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰OD值度数。

● 若细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化或pH发生变化，建议更换新鲜的培养基后再加CCK-8试剂。含有酚红的培养基可用于本试剂盒做细胞活性的测定，酚红不会影响检测。

● 如果不是使用96孔板检测，CCK-8溶液的用量相应等比例增加即可。

● 本试剂盒可以用于细菌的检测，不可用于酵母检测。

● CCK-8试剂加样量较小时，也可以用培养基稀释CCK-8试剂后加样以减小误差。

● 本试剂无细胞毒性，可以在检测后进行细胞培养，也可以再进行其他检测。

● 某些细胞实验中吸光度值太高，可以减少细胞数量，或者缩短加入CCK-8后的培养时间。

● 如果OD值偏低，可以适当增加细胞数量或延长加入CCK-8后的培养时间。

● 接种细胞时要充分重悬，接种均匀。细胞是否接种均匀对结果影响较大。

● OD值在0.5-2.0之间均可，在1.0左右最佳，小于0.5或大于2.0请调整接种量和培养时间。

使用方法：

细胞活性、细胞增殖-毒性检测

1、收集细胞，加细胞悬液100μL(约5000-10000个细胞)到96孔板(边缘孔用无菌水或PBS填充)。每板设对照(加100μL培养基)。

2、置37℃,5% CO₂孵育过夜，倒置显微镜下观察。

3、每孔加入10μL待检测药物溶液，37℃孵育。

4、每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育1-4小时。

5、测定450nm各孔的吸光值，如无450nm滤光片，可以使用450-490nm的滤光片。

6、同时设置空白孔(培养基和CCK-8溶液，无细胞)，对照孔(不加药培养基和CCK-8溶液，有细胞)，每组设定3-5复孔。

【注】：

● 如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μL 0.1M HCI溶液或者1%w/v SDS溶液，井遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

● 如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影晌。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

细胞活力计算：

将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。

细胞活力％=(加药细胞OD-空白OD/对照细胞OD-空白OD)×100

细胞数量测定

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2、按比例(例如：1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每孔3-6个复孔。

3、接种后培养基24小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用 此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间)。

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