HR0959-100T 线粒体膜通透性转换孔(MPTP)检测试剂盒

本试剂盒按每个样品500μL计算，可供200-1000次检测。CA最大激发波长495nm，最大发射波长515nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为510～530nm。可以使用流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测细胞内mPTP的变化。...

试剂盒以外自备试剂和仪器：

● Hanks balanced salt solution（HBSS）或HEPES或PBS ● 移液器 ● 流式细胞仪/激光共聚焦显微镜

注意事项：

● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

● 染色后立即进行分析。

● 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先确定最佳条件。以下方法仅供参考。

● CA1容易受潮，稳定性较差，注意干燥保存。

使用方法：

1、染色工作液的配制：

1.1 1×MPTP 染色buffer配制：用纯水10倍稀释10×MPTP染色buffer， 配制1×MPTP染色buffer。

1.2 CA1染色工作液配制：根据样品数量用1×MPTP 染色buffer稀释CA1探针500倍，配制成CA1染色工作液，充分混匀。

2、细胞染色

2.1 将样品细胞制备成单细胞悬液，使其密度为1×10⁶细胞/mL。

【注】：

● 用于加Ca²⁺通透剂的对照样品的缓冲液必须含有Ca²⁺；

● CA1探针加载时不能含有血清；

● 细胞必须为单细胞悬液。

2.2 按照500μL每管将细胞悬液等分，每个样品等分成3份，并记录编号。

【注】：

● 后续染色顺序：1号管仅含CA1探针，2号管含CA1探针和淬灭剂，3号管含CA1探针，淬灭剂和通透剂，另外准备一管不加试剂的细胞样品用于相应的仪器设置。

2.3 向上述每个样品的3管中分别加入3μL CA1探针工作液并混匀。

【注】：

● 推荐该探针加载浓度在200-400倍稀释，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

2.4 向2号、3号管中加入5μL淬灭剂，并混匀。

2.5 向3号管中加入5μL 通透剂，并混匀。

2.6 在37℃避光孵育15分钟。

2.7 向每管中加入3mL 1×MPTP染色buffer，离心收集细胞。

【注】：

● 此步可去除多余染料以及可能引起荧光淬灭的试剂。

2.8 用400μL同时可用于流式检测的合适的缓冲液重悬细胞。

【注】：

● 如果需要，也可进行进一步染色。如用标记的Annexin V检测磷酯酰丝氨酸易位(HR0399)；用PI检测细胞活力；或者用M11探针检测线粒体活力等。注意整个过程均需避光操作。

2.9 染色后，将样品置于冰上，1 小时内进行流式分析。

3、细胞检测

用不含试剂的细胞样品进行相应的仪器设置。用流式488 激发器进行荧光分析，CA1探针最大激发波长495nm，最大发射波长515nm。

1号管-仅含CA1探针：线粒体和胞浆有荧光，荧光信号较强；

2号管-含CA1探针和淬灭剂：仅线粒体呈现荧光，荧光强度居中；

3号管-含CA1探针，淬灭剂和通透剂：线粒体和胞浆荧光均被淬灭，荧光信号最弱。

2号管和3号管荧光信号的变化说明线粒体通透性转换孔被不断的激活。

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