样品制备原则

    样品制备是双向电泳中zui关键的一步，将直接影响2-DE结果好坏。目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提zui大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

    根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents），zui常用的是二硫苏糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂以及核酸酶。

    样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的zui大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条，这样都会造成2-DE的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。

    核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在zui终的2D胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。

    因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。目前有很多方法适于2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白（如磷酸化蛋白、采用亲合纯化凝集素结合蛋白等）。

    一、细胞样品

    1. 细胞培养，加药与处理。

    2. 胰酶消化贴壁细胞，PBS漂洗3次(1500ｇ，5min)，弃上清, 再次离心，去尽残液（非常重要！）。如要比较细胞膜蛋白组的差别，zui-好用细胞刮收获细胞。如用10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替PBS，可有效降低样品的盐浓度。

    加入5倍体积裂解液，混匀（或将1×106细胞悬于60～100?l裂解液中）。

    3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml Dnase，在4℃放置15分钟。

    4. 15,000转，4℃离心60分钟（或40,000转，4℃离心30分钟）。

    5. 收集上清。

    6. 测定蛋白浓度(采用BioRad RC/DC protein assay kit)。

    7. 分装样品，冻存于－70℃。

    二、组织样品

    1. 碾钵碾磨组织，碾至粉末状。

    2. 将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。

    3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml DNase，在4℃放置15分钟。

    4. 15,000转，4℃离心60分钟（或40,000转，4℃离心30分钟）。

    5. 收集上清，测定蛋白浓度。

    6. 分装样品，冻存于－70℃。

    注意事项：

    1. 8 mmol/L PMSF必须在添加还原剂之前用，否則PMSF会失去活性。

    2. 40 mmol/L浓度以下的Tris可使有些蛋白酶在高pH值下失活。

    3. 细胞清洗――大多用PBS，若PBS残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹，则可利用(10 mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此问题。

    双向电泳操作步骤

    水化上样(被动上样)

    1. 从冰箱中取出IPG胶条，室温放置10min。

    2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各1cm左右不加样，中间的样品液一定要连贯.注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。

    3. 用镊子轻轻撕去IPG胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。

    4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上.注意:不要将样品溶液弄到胶条背面,因为这些溶液不会被胶条吸收;还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。

    5. 放置30~45min大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约3ml(17cm IPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。

    6. 置等电聚焦仪于-20℃水化11~15h。

    第1向 等电聚焦

    1. 将纸电置于聚焦盘的正负上，加ddH2O 5~8?l润湿。

    2. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。

    3. 将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正（标有+）对应于聚焦盘的正，确保胶条与电紧密接触。

    4. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油。

    5. 对好正、负，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

    6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10分钟，使其溶解。

    第二向SDS-PAGE电泳：

    1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶。

    2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

    3. 配制胶条平衡缓冲液I

    4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

    5. 将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml(17cm IPG)平衡缓冲液I，在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

    6. 配制胶条平衡缓冲液II。

    7. 第1次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液II中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

    8. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。

    9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。

    10. 在100ml量筒中加入TGS电泳缓冲液。

    11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

    12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中漂洗数次。

    13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。

    14. 用适当厚度的胶片,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触.注意:不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。

    15. 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。

    16. 打开二向电泳制冷仪，调温度为15℃。

    17. 将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用的低电流（5mA~10mA/gel/17cm），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（20-30mA/gel/17cm）待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

    18. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。

    19. 进行染色。

    双向电泳蛋白点的切取和保存：

    1. 用PDQuest软件或肉眼比对，找出感兴趣的蛋白点，并做好标记和记录。

    2. 用MilliQ水冲洗胶2次。

    3. 用色谱纯甲醇和MilliQ水冲洗Ep管

    4. 将枪头(200?l)下端剪去，使其内径略小于蛋白斑点的直径，用色谱纯甲醇和MilliQ水冲洗枪头。

    5. 对准斑点中央小心将蛋白切割下来，放入Ep管，MilliQ水漂洗2次，如胶块太大，将其切成1 x 1 mm的胶片。

    6. 将切好的点做好标记和记录，置-80oC保存或冻干后-20oC存放。

    注意事项：

    1. 尽量避免皮肤和头发的角蛋白的污染，在操作过程中应戴一次性的PE手套（不用乳胶手套）和帽子。

    2. 不要将胶长期存放于乙酸溶液中。

    3. Ep管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗，尤其应与进行Western blotting的容器分开，以避免casein或BSA的污染。