（一）概述

微载体培养技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。

微载体培养是目前公认的zui有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。

目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。


微载体是指直径在60.250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。自VanWezel用DEAE-SephadexA50研制的第1种微载体问世以来，国-际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯饱沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种：Cytodexl、2、3、Cytopore和Cytoline。

增大单位体积内表面积（S/F)对细胞的生长非常有利。微载体直径尽可能小，zui好控制在100-200μm之间。培养体系内微载体的密度一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。

（二）微载体培养原理与操作

1．微载体培养原理

将无细胞毒性的微载体颗粒加入到培养容器的培养液中，使细胞在微载休表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞在徽载体表面上的增殖，要经历戮附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。豁附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面豁附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。

2．微载体培养操作

搅拌转速由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作是，在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停。数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，zui大速度75r/min。

细胞与微载体的相融性好坏，与微载体表面的理化性质有关。一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于赫附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。

影响细胞在微载体表面生长的因素很多，主要有三个方面：①培养细胞方面，如细胞群体、状态和类型。②微载体特性方面，如微载体表面状态、吸附的大分子和离子。徽载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。③培养液组成及其特性，如培养基组成、沮度、pH、DO以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件zui优，则细胞生长快，反之生长速度慢。

微载体培养操作要点：①培养初期。保证培养基与微球体处于稳定的pH与温度水平，接种对数生长中晚期细胞至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微载体含量，geng高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。②贴壁阶段。3-8d后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。③培养维持期。进行细胞计数、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液。换液时，停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入37℃新鲜培养液，重新开始搅拌。④收获细胞。首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，75-125r/min快速搅拌20-30min。然后解离收集细胞及其产品。

可以通过增加微载体的含量或培养体积进行微载体培养的放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L以上。

（三）微载体培养的优点

微载体培养由于表面积／体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高。把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点。可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况。简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好。培养基营养成分的利用率较高。容易放大，细胞收获过程不复杂，劳动强度小，培养系统占地面积