1.样本准备：

1） 收集细胞。经刺激和阻断处理的细胞（具体处理方案请参考文献进行），加细胞染色Buffer（或含0.1%BSA的PBS）制成单细胞悬液，调整细胞浓度约为1×107/ml。

2） 取100μl细胞/管（约1×106细胞），分别加到做好标记的流式管底部。

2.固定：

1） 如需要表面染色，选用适宜抗体进行表面染色。

2） 用100uL的1×细胞固定/破膜液（Fixation/Permeabilization buffer），将流式管中的细胞重悬，室温避光孵育30分钟。

3） 用300g离心5分钟，弃去上清。

3.破膜：

1） 用2mL的1×细胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer）将固定过的细胞重悬，300g离心5分钟，弃去上清。

2）重复洗一次，300g离心5分钟，弃去上清。

3） 加入1ml的1×细胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer），4℃避光孵育30分钟；300g离心5分钟，弃去上清。

4.胞内染色：

1）用100μl 的1×细胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer）重悬细胞，加入相应的抗体，混匀，4℃避光孵育至少30分钟。

2）加入2ml的1×细胞破膜Buffer（Permeabilization Buffer）重悬细胞，300g离心5分钟，弃去上清。

3）加入2ml的1x细胞染色Buffer（或含0.1%BSA的PBS）悬起细胞，300g离心力离心5分钟，弃去上清。

4）加入0.5ml的1x细胞染色Buffer（或含0.1%BSA的PBS）重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析。

注意事项：

1. 同一个细胞同时做细胞表面和细胞内的蛋白，建议先做细胞表面染色，再固定、破膜。

2. 细胞内染色推荐使用同型对照。