标签：超氧化物歧化酶 古朵生物 ELISA试剂盒

  古朵生物| 超氧化物歧化酶试剂盒说明书(NBT法)

  正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

  测定意义：

  SOD(EC 1.15.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成H2O2和O2。SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。

  测定原理：

  通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-.)，O2-.可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560nm处有吸收;SOD可清除O2-.，从而抑制了甲臜的形成;反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。

  超氧化物歧化酶试剂盒组成：

  产品名称SR002-100T/96SStorage

  提取液：液体100ml4℃

  试剂一：液体5ml4℃

  试剂二：液体200μl4℃

  试剂三：液体4ml4℃

  试剂四：粉剂2瓶4℃

  说明书一份

  自备仪器和用品：

  酶标仪、离心机、移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水

  粗酶液提取：

  1、细菌、细胞或组织样品的制备：

  细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500~1000：1的比例(建议500 万细菌或细胞加入1ml提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次);8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

  组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为1：5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

  2、血清(浆)样品：直接检测。

  测定步骤：

  1、 酶标仪预热30min以上，调节波长至560nm。

  2、 将试剂二用蒸馏水稀释两倍，用多少配多少。(试剂二和蒸馏水1：1稀释)

  3、 将一瓶试剂四用5ml蒸馏水溶解(溶解后一周内用完)，再用蒸馏水稀释4倍，用多少配多少(试剂四和蒸馏水1：3稀释)。

  4、 测定前将试剂一、三和四在37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)水浴5min以上。

  5、 样本测定(在EP管或96孔板中依次加入下列试剂)

  试剂名称(μl)测定管对照管

  试剂一4545

  试剂二22

  样本 18

  蒸馏水

  18

  试剂三3535

  试剂四100100

  充分混匀，室温静置30min后，560nm处测定各管吸光值A。

  超氧化物歧化酶试剂盒注意事项：

  1、试剂二为酶，不可冷冻，使用时在冰上放置。

  2、对照管只需要做一管。

  3、若对照管吸光值大于1，建议将试剂二用蒸馏水稀释7倍后使用(10μl试剂二原液+60μl蒸馏水)。

  4、SOD为什么有的样本测定管大于对照管，对照管数值在什么范围?

  对照管的范围是0.4-1。对照管吸光值过低可能是(1)试剂二或试剂四没有现配现用;(2)没有按顺序加试剂;(3)反应时间不够，可以延长反应时间(反应时间30min可以延长到40min)。对照管吸光值过高可能是试剂二未按操作说明书稀释相应倍数。

  若出现测定管大于对照管，可能是样本中杂质的影响太大，为了降低杂质的影响一般将样本提取上清液用蒸馏水或提取液稀释10倍后再测，通常可以使测定正常。计算公式中乘以相应稀释倍数。

  SOD活性计算：

  抑制百分率的计算

  抑制百分率=(A对照管-A测定管) ÷A对照管×

  尽量使样本的抑制百分率在10-90%范围内。如果计算出来的抑制百分率小于10%或大于90%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需将样本用提取液适当稀释;如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本。

  2、SOD酶活性单位：在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(U/ml)。

  3、SOD酶活性计算：

  (1)血清(浆)SOD活性(U/ml)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷V样=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)

  (2)组织、细菌或培养细胞SOD活力计算：

  a.按样本蛋白浓度计算

  SOD活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(V样×Cpr) =11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。

  b.按样本鲜重计算

  SOD活性(U/g 鲜重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(W ×V样÷V样总)=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W

  c.按细菌或细胞个数计算

  SOD活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×V反总]÷(500×V样÷V样总)=0.022×抑制百分率÷(1-抑制百分率)

  V反总：反应体系总体积，0.2ml;V样：加入反应体系中样本体积，0.018ml;V样总：加入提取液体积，1 ml;Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml ;W：样本质量，g;500：细胞或细菌总数，500万。

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