甘油检测试剂盒(组织，细胞)的原理

  描述：甘油是甘油三酯的水解产物。与游离脂肪酸一样，甘油含量是甘油三酯水解反应的可靠检测指标，但检测加方便。本试剂盒采用优化步骤，能够检测实体组织、细胞中的甘油含量，线性范围为10-1200µmol/L

  原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化为 3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化产生过氧化

  氢;在过氧化物酶作用下生色底物转化为苯醌亚胺，其光密度值与甘油浓度成正比。

  适用范围：测定实体组织、细胞中的甘油浓度。组成 (105 次微板测定或 30 次 1 ml 比色杯测定)：

  (1) 裂解液 50 ml

  (2) R1 试剂 16 ml

  (3) R2 试剂 4 ml

  (4) 4 mmol/L 甘油标准品 1 ml

  4 ºC，储存 3 月。

  所需设备：酶标仪、生化分析仪或 721、722 型可

  见光分光光度计。佳工作波长 550nm，如无此波

  长建议优先选用 570nm、次选 530、490nm。

  一 组织细胞裂解

  细胞(包括分化的脂肪细胞)裂解： 消化、离心收集细胞。或直接在培养皿内裂解。通常6孔板单孔约2x106个细胞，75cm2瓶约1x107细胞。按比例每 1~2 x 106细胞加 0.1ml 裂解液，混匀，静置 10 分钟。

  动物组织裂解：

  切记要预先将新鲜组织剪切称重后再进行保存。组织冻存后再进行解冻、剪切、称重可能会产生严重的测量误差。离心管称重，加入组织块后再称重，二者相减(即减量称重法)计算组织量(约 100mg)。强烈建议按比例每 1mg 组织加10µl裂解液以减少样品间蛋白和脂质含量变异而产生的误差。(注意;裂解液用量在 1ml 或多可保证有效的裂解与脂质提取)。用电动高速匀浆器或手动玻璃匀浆器破碎组织。(不推荐超声方法，因其不能*和均匀破碎。应根据预实验调整初始的组织细胞加入量)，而后，静置 10 分钟。

  二. 裂解液处理：

  1. 取适量上清液转移到 1.5ml 离心管中，进行步骤

  2 的操作。余下的裂解液可用 BCA 法蛋白定量试剂盒进行蛋白定量或-20ºC 储存。

  2. 70ºC 加热 10 分钟灭活脂肪酶，可能出现絮状沉淀。

  3. 室温 5000rpm 离心 5 分钟，上层清液即可用于酶学测定。

  三 工作溶液配制：按 4:1 比例，取 4 ml 试剂 R1 与1 ml 试剂 R2 混合即可，立即使用或 4ºC 保存<1 天，变色弃去。(注意：谨防来源不明但容易发生的甘油污染，可来自操作者本人或标准品液体微粒溅射等。)

  四 标准品稀释：用蒸馏水、生理盐水或与样品缓冲液*的液体，将 4 mM 甘油标准品倍比稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125µmol/L，通常取其中 4~6 管即可，注意设置 0 浓度对照反应管。

  五 甘油测定

  1. 参见下表加样。待测样品体积 10µl，多加可能会抑制反应。

  2. 37ºC 或 25ºC 反应 10 分钟。反应平衡后颜色在60 分钟内稳定。

  3. 先用蒸馏水+工作液的空白管调零，然后测定各管 OD 值。

  4. 绘制标准曲线并计算甘油浓度。

  附 Excel 作图步骤：各标准管 OD 值为 y 轴，标准品浓度为 x 轴。(1)鼠标左键圈住数据，点击做图向导，选择-散点图-，点击-完成-。(2)鼠标右键点图上的某一点，点击-添加趋势线-，点击-选项-，点击-显示公式-和-R2 值-。

  5. 以每 mg 蛋白浓度或细胞数校正甘油含量。见说明书

  说明：

  1.血红蛋白>2g/L、胆红素>0.25g/L、二硫苏糖醇、巯基乙醇、高浓度EDTA干扰测试。

  2.红细胞糖酵解时合成磷酸甘油影响测定。

  参考文献：

  1. Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.

  2. Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145

  甘油检测试剂盒(组织，细胞)的原理

  甘油检测试剂盒(组织，细胞) 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。