质粒DNA的酶切原理和操作步骤

  1.目的

  学会用限制性内切酶切割质粒DNA。

  2.原理

  II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电泳酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。

  3.器材

  旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。

  4.试剂

  Pinpoint?xa-3质粒，EcoR V，BamH I，内切酶缓冲液(10×)，10×电泳加样缓冲液，荧光染料。

  5.实验准备

  配制TAE电泳缓冲液(50?储存液)，10?加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。

  6.操作步骤

  (1)混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中：

  Pinpoint?xa-3 DNA (或pUCm-T-CHI ) 6 μl

  10×酶切缓冲液(用EcoRV的缓冲液) 2 μl

  ddH2O 30 μl

  EcoRV 1μl

  BamHI 1μl

  总体积 40μl

  (2)先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。

  (3)用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部(以免手指的给酶液加温)，另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 μl限制性内切酶。

  (4)在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后(立即把内切酶原液送回冰柜!)，轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推荐的适酶切温度水浴中温育1~3 h(一般是 37℃)。

  (5)酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA(如先前的PCR产物)对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。

  (6)酶切后的质粒可以回收备用(见实验六：从琼脂糖凝胶中回收DNA片段)。

  (7)清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。

  质粒DNA上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。