人白介素-18(IL-18)ELISA试剂盒使用说明原理

  本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗人 IL-18 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 IL-18与单抗结合，加入生物素化的抗人IL-18，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，IL-18浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-18浓度。

  试剂盒组成(2-8℃保存)

  酶标板(Coated Wells)96孔酶标抗体工作液(Enzyme Conjugate)12ml

  10×标本稀释液(Sample Buffer)12ml20×浓缩洗涤液(Wash Buffer)50ml

  标准品(Standards)：20ng/瓶2瓶底物工作液(TMB Solution)12ml

  抗体工作液(Biotinylated Antibody)12ml终止液(Stop Solution)12ml

  准备试剂与收集血样

  1. 收集标本：血清、血浆(EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝)、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时;长时间须冷冻(-20 ℃或-70 ℃)保存，避免反复冻融。血清、血浆、细胞培养上清至少作1：2稀释(取50ul，加标本稀释液50ul,稀释2倍)。

  2. 标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。设标准管8管，管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

  3. 10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。

  4. 洗涤液：用重蒸水1:20稀释(示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)

  检测程序

  1. 加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

  2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

  3. 每孔中加入抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

  4. 洗板：同前。

  5. 每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。

  6. 洗板：同前。

  7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。

  8. 每孔加入100ul终止液混匀。

  9. 30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

  结果计算与判断

  1. 所有OD值都应减除空白值后再行计算。

  2. 以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

  3. 根据样品OD值在该曲线图上查出相应IL-18含量，再乘上稀释倍数即可。

  试剂盒性能

  1. 灵敏度：小的IL-18 检测浓度小于15pg/ml。

  2. 特异性：可同时检测重组或天然的人IL-18。不与人其它细胞因子有交叉反应。

  3. 重复性：板内、板见变异系数均小于10%。

  注意事项

  1. 以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

  2. 洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致度误差及OD值错误地升高。

  3. 板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。

  4. 本试剂盒宜置4oC冰箱保存。

  5. 本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断!

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