β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性检测试剂盒技术说明书

  产品规格：50管/24样

  产品内容：

  溶液的配制：

  1. 试剂一：临用前每瓶加入5mL双蒸水，充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。

  2. 标准品：5μmol/mL的对硝基苯f溶液。

  产品说明：

  β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。

  β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯f，后者在400nm有大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。

  注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。

  需自备的仪器和用品：

  可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

  操作步骤：

  一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

  1. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个)：提取液体积(mL)为500~1000：1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次);15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

  2. 组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液)，进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

  二、测定步骤：

  1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。

  2. 标准液的处理：用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL。

  3. 样本测定(在EP管中依次加入下列试剂)：

  三、β-GAL活性计算：

  1. 标准曲线的建立：

  根据标准管的吸光度(x，减去浓度为0的标准管OD值)和浓度(y，nmol/ml)建立标准曲线， 将△A带入标准曲线中，计算样品生成的产物量(nmol/ml)。

  2. β-GAL活性计算：

  (1)按样本蛋白浓度计算：

  单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯f定义为一个酶活力单位。

  β-GAL活力(nmol/h /mg prot)=(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T

  =20×y÷Cpr

  蛋白浓度需要另外测定。

  (2)按样本鲜重计算：

  单位的定义：每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯f定义为一个酶活力单位。

  β-GAL活力(nmol/h /g鲜重)=(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T

  =20×y ÷W

  (3) 按细菌或细胞密度计算：

  单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯f定义为一个酶活力单位。

  β-GAL活力(nmol/h /104 cell)= (y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T

  =0.04×y

  Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL;V反总：反应体系总体积，0.5mL;V样：加入反应体系中样本体积，0.05mL;V样总：加入提取液体积，1mL;W：样本质量，g;500：细胞或细菌总数，500万;T：反应时间，0.5h。

  β-半乳糖苷酶检测试剂盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。