琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程

  凝胶电泳操作注意事项：

  1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。

  2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。

  3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。

  4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象明显。

  5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。

  6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。

  7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。

  琼脂糖加样时候注意事项：

  1、 用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。

  2、 常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。

  3、 在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料(如溴酚蓝)，用以看出样品移动的距离。

  4、 在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。

  5、 电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。

  6、 电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭(EB)中，5min后即可看到DNA带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。

  7、 在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。

  8、 如果要对某一条带(如质粒)进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收DNA。

  琼脂糖核酸电泳实验操作流程

  1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子;

  2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液(一般20~30 ml);

  3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固;

  4.室温下30~45分钟后凝胶*凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内;

  5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去;

  6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液(loading buffer)，混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内;

  7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可;

  8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳;

  9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

  琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的jia分辨范围

  0.5%1,000～30,000

  0.7%800～12,000

  1.0%500～10,000

  1.2%400～7,000

  1.5%200～3,000

  2.0%50～2,000

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