免疫荧光双标技术HE染色的原理

  免疫荧光双标技术称HE染色原理，根据易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia );而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性(neutrophilia)。构成组织内蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。

  免疫荧光双标技术而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性;pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。

  免疫荧光双标技术所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。脱氧核糖核酸(DNA)两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

  免疫荧光染色需要注意的知识：

  (1)古朵生物提醒：由于荧光容易淬灭，一般仅能维持几个小时，因此，荧光二抗应避光保存，即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作。封片后应尽早照相，目前有市售的荧光增强剂，可使荧光在4℃保存1-2周仍不淬灭。

  (2) 免疫荧光染色常用的荧光素有以下几种，绿色荧光：FITC、 Alexa Fluor 488和GFP;红色荧光：TRITC、Cy3、Alexa Fluor 568&594和MitoTrackerRed;蓝色荧光：Hoechst、DAPI;黄色荧光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。

  (3)陕西依科生物提醒，不同的荧光素激发的波长不同，因此，选用滤光片时要注意。一般紫外线的激发波长为334-365nm，蓝光的激发波长为435-490nm，绿光的激发波长为546nm左右。

  (4) 荧光显微镜应提前至少15min打开汞灯预热。关闭30min后方可再开启。

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