细胞增殖检测试剂盒说明书

 

  细胞增殖检测试剂盒

  原理：EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名为5-乙h基-2' -脱氧尿苷，是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其炔羟基团在天然化合物中很少见，在细胞增殖时能够替代胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷，thymidine) 插入正在复制的DNA分子中， EdU上的乙h基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如Azide Alexa Fluor 488等)通过一价铜离子催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应(Click reaction)，从而可以进行高效快速的检测细胞增殖，特别是可以有效地检测处于S期的细胞百分数。

  与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比， EdU只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内容易扩散，不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，具有高的灵敏度和快的检测速度。

  规格：200T

  有效期：12个月

  试剂盒组成

  货号Code品名Product name储存条件Storage condition

  10mL-20℃

  1mL*2-20℃

  400μL-20℃

  色原50μL-20℃

  EdU母液 100μL-20℃

  备注：AC为粉剂，使用之前需要加入1mL纯水，充分溶解之后再使用，AC容易氧化失效，不使用时放入冰箱-20度保存，如发现变色，需换新鲜试剂。

  实验流程

  1.样本处理

  1.1动物实验

  1.1.1动物EdU注射

  对于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定浓度，腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关，可以参考相关文献，因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的浓度进行测试。

  注射方式:依据客户实验而定，如腹腔注射，皮下注射，肌肉注射，尾静脉注射等，其中以腹腔注射为多。

  6小时后或根据特定实验确定适当的时间后，快速处死小鼠，取出所需组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时候也可参考相关文献自行调整。

  建议任何实验均可取小肠组织检测细胞增殖情况，小肠上皮组织细胞增殖快，成年小鼠EdU注射6小时后即可检测到阳性信息，可用作阳性对照进行预实验。

  1.1.2切片处理

  切片前处理：组织器官好进行清洗，以去除血液、组织中残留的EdU，降低背景。

  切片厚度：3-10μm为宜，切片过厚可能会影响切片背景及染色效率。

  切片后处理：

  石蜡切片脱蜡：二甲b脱蜡2次，15分钟/次，梯度乙醇(，95%，85%，75%)各一次，5分钟/次，去离子水洗脱1次。

  冰冻切片处理：室温放置30分钟后，固定10分钟，PBS清洗3次，每次5分钟。

  1.2细胞实验

  1.2.1细胞EdU标记

  用细胞培养基和EdU母液按8000：1的比例稀释，制备适量50μM的EdU培养基;

  每孔加入适量50μM的EdU培养基孵育2小时，弃培养基(佳孵育时间一般为细胞周期的1/10),EdU培养基和EdU反应液孵育体积可参考下表;

  3)PBS清洗细胞3次，每次5分钟

  96孔板48孔板24孔板12孔板6孔板5.5cm小皿

  EdU培养基100μL200μL300μL500μL1mL2mL

  EdU反应液100μL200μL300μL500μL1mL2mL

  1.2.2细胞固定通透

  1)每孔加入细胞固定液(含4%的多聚甲醛的PBS)室温孵育15分钟，弃固定液，PBS 清洗3次，每次5 分钟。;

  2)每孔加入渗透剂(0.5% TritonX-100 的 PBS)脱色摇床孵育 15 分钟;PBS 清洗3次，每次5 分钟。

  2.EdU反应

  按照PB：CU：AC：647色原=860：40：100：5的比列配制EdU反应液(反应液现配现用)。

  每个样本滴加50-100μL的EdU染色反应液(反应液均匀覆盖样本)，室温避光孵育15-60分钟，弃染色反应液，PBS冲洗3次，每次5分钟。

  3.DAPI染色

  每个样本加入50-100μL DAPI染色液，染色15分钟，PBS清洗3次，每次5分钟。

  4.图像拍照

  染色完成后建议立刻观察，使用荧光显微镜、共聚焦显微镜或者全片扫描仪进行采集图像，染色完玻片避光4℃保存。

 

  以上是50mg/kg标记小鼠6小时的染色图像

  实验前须知

  EdU 的分子量为 252.23，易溶于水，PBS，生理盐水。

  对于动物实验，建议将EdU粉末溶解于DMSO配制成100mg/ml的母液。

  EdU 建议初始给药量为 50mg/kg(50μg/g)，稀释浓度为 0.5~1mg/mL。小鼠体重20g，需要注射1mg，以1mg/mL计算，需要注射1mL。

  Edu0.1mg1mg2mg10mg

  PBS100μL1mL2mL10mL

  对于细胞实验， EdU母液质量浓度为100mg/mL，转化为物质的量浓度为400mM，建议将EdU母液稀释成50mM储存液，推荐的EdU工作浓度为10μM。

  文章引用试剂盒/方法：Staining of EdU was performed using a EdU cell proliferation Assay kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the click chemistry technology according to the manufacture’s instruction.

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