还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)试剂盒说明书

  微量法 100T/96S

  注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

  测定意义：

  GSH是细胞内主要的抗氧化巯基物质，在抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜运输等中具有重要作用。还原型与氧化型比值(GSH/GSSG)是细胞氧化还原状态的主要动态指标。因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。

  测定原理：

  DTNB与GSH反应生成复合物，在412nm处有特征吸收峰;其吸光度与GSH含量成正比。

  自备仪器和用品：

  低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。

  试剂组成和配制：

  试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

  试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

  试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。

  粗酶液提取：

  组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

  细菌、真菌：按照细胞数量(104个)：试剂一体积(mL)为500~1000：1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min);然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

  血清等液体：直接测定。

  GSH测定操作：

  1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。

  2. 试剂二置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴中保温30min。

  3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL蒸馏水，140μL试剂二，40μL试剂三，混匀静置2min后测定412 nm吸光度A1。

  4. 测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，140μL试剂二，40μL试剂三，混匀静置2min后测定412 nm吸光度A2。

  注意：空白管只需要测定一次。

  GSH含量计算公式：

  GSH标准曲线公式：y=1.5 x(x为GSH浓度，μ mol /mL;y为吸光值)

  a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

  (1)按蛋白浓度计算

  GSH(μ mol/ mg prot)=(A2-A1) ÷1.5×V样÷(V样×Cpr) =0.667×(A2-A1) ÷Cpr

  (2)按样本质量计算

  GSH(μ mol/g 鲜重)=(A2-A1) ÷1.5×V样÷(V样÷V样总×W)=0.667×(A2-A1) ÷W

  (3)按细胞数量计算

  GSH(μ mol /104 cell)=(A2-A1) ÷1.5×V样÷(V样÷V样总×细胞数量)=0.667×(A2-A1) ÷细胞数量

  (4)按液体体积计算

  GSH(μ mol/ mL)=(A2-A1) ÷1.5×V样÷V样 =0.667×(A2-A1)

  V反总：反应总体积，0.2mL;V样总：上清液总体积，1 mL;V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL;Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL;W：样品质量

  b.使用96孔板测定的计算公式如下

  GSH标准曲线公式：y=0.75x(x为GSH浓度，μ mol /mL;y为吸光值)

  (1)按蛋白浓度计算

  GSH(μ mol/ mg prot)=(A2-A1) ÷0.75×V样÷V样÷Cpr =1.334×(A2-A1) ÷Cpr

  (2)按样本鲜重计算

  GSH(μ mol/g 鲜重)=(A2-A1) ÷0.75×V样÷(V样÷V样总×W)=1.334×(A2-A1) ÷W

  (3)按细胞数量计算

  GSH(μ mol /104 cell)=(A2-A1) ÷0.75×V样÷(V样÷V样总×细胞数量)=1.334×(A2-A1) ÷细胞数量

  (4)按液体体积计算

  GSH(μ mol/ mL)=(A2-A1) ÷0.75×V反总÷V样 =1.334×(A2-A1)

  V样总：上清液总体积，1mL;V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL;Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL;W：样品质量，g。

  注意事项：

  试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。

  低检出限为0.011mmol/L。

  还原型谷胱甘肽试剂盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。