技术原理：免疫荧光染色原理及步骤

  免疫荧光又称免疫荧光抗体。免疫荧光实验原理是将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

  下面古朵生物详细介绍免疫荧光染色步骤：

  1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

  2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间(参考：30min)。

  3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。

  4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

  5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+"表示：(-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱，但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++--++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++"以上，而各种对照显示为(±)或(-)，即可判定为阳性。

  免疫荧光实验操作步骤：

  一、细胞准备：

  对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

  二、固定和透化

  1. 在培养板中将已爬好细胞的盖玻片用1 × PBS浸洗3次，每次3 min。

  2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，1 × PBS浸洗玻片3次，每次3 min。

  3. 0.5% Triton X-100(1× PBS配制 )室温通透细胞15 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤), 1 × PBS浸洗玻片3次，每次3min。

  三、封闭

  4. 吸水纸吸干1 ×PBS，在玻片上滴加5%的正常血清(与二抗种属来源一致或相似)，室温封闭1 h。

  四、抗体孵育

  5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜。

  6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min。

  注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

  五、固定拍照

  7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。

  8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察采集图像。

  免疫荧光染色 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。